Optimización del análisis de ADN de restos óseos críticos

Abstract

El descubrimiento en 1986 de las aplicaciones forenses del análisis de ADN con fines de identificación supuso una revolución en el campo de las Ciencias forenses, consolidándose como una de las disciplinas más aceptadas por los tribunales de todo el mundo. Sin embargo, y pese a la multitud de avances que han enriquecido la disciplina como la PCR en un primer momento o la secuenciación masiva más recientemente, la Genética forense no ha estado exenta de problemas, como son los perfiles mezcla, las muestras mínimas, o la degradación del ADN. En contextos como el crimen organizado, el terrorismo, las grandes catástrofes, o las fosas comunes, el análisis de ADN en restos humanos suele constituir la única vía posible para la identificación, habida cuenta que huesos y dientes son las únicas muestras biológicas que permanecen con el paso del tiempo. Este tipo de muestras son especialmente desafiantes para los laboratorios de Genética forense, puesto que, además de tener poca cantidad de ADN, este suele encontrarse degradado. A este hecho se une la dificultad, en algunos contextos en los que el suceso y las actuaciones de identificación están muy separadas en el tiempo, de la relación familiar distante entre las muestras de restos humanos y los familiares de referencia con los que se harán las eventuales comparativas. La optimización y puesta a punto de los protocolos de análisis de restos humanos degradados para un máximo rendimiento en la obtención de un perfil genético resulta, por tanto, de especial interés para la disciplina. El Laboratorio de Identificación Genética de la Universidad de Granada, primero con el programa Fénix y más recientemente con el convenio con la Junta de Andalucía de identificación de las víctimas de la Guerra Civil y la Posguerra española, cuenta con una amplia experiencia en el análisis de restos humanos críticos. Es por ello por lo que se constituyó como el crisol para la realización de esta tesis doctoral, aportando tanto su experiencia previa y presente como la disponibilidad de muestras para los diferentes análisis realizados. El objetivo de la presente tesis doctoral es la optimización del análisis de ADN, en el contexto forense, de restos humanos críticos (huesos y dientes). Para ello se ha realizado una revisión de las diferentes etapas del análisis de ADN: la muestra de restos óseos/dientes, extracción, cuantificación, amplificación, secuenciación, visualización de resultados e informe, revisando también las pautas para asegurar la calidad del proceso en el marco de la norma ISO 17025. Para cada etapa analítica se ha tratado de hacer una comparación de las diferentes técnicas analíticas disponibles, buscando la que mejor rendimiento mostraba para cada una de ellas: En el Capítulo 1, sobre la muestra de restos óseos o dientes, se comparó el rendimiento del análisis de ADN en diferentes restos humanos del mismo individuo: fémur, tibia, dientes, y hueso petroso. Se observó que tanto los dientes como el hueso petroso, especialmente este último, son, en general, los mejores sustratos para obtener un perfil genético. En el Capítulo 2, sobre la extracción de ADN se compararon cinco protocolos de extracción distintos: extracción orgánica, sílice en suspensión, sílice en columna, y con los kits comerciales PrepFiler™ BTA e InnoXtract™. Se vio que el protocolo de extracción orgánica con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico era el que mejor rendimiento tenía en términos de cuantificación y de perfil genético obtenido. En el Capítulo 3, sobre la cuantificación de ADN, se comparó la eficiencia de cuatro kits comerciales de qPCR: Quantifiler™ Trio, PowerQuant™, Quantiplex® Pro, e InnoQuant™ HY. Este último kit destacó en términos de sensibilidad a la hora de detectar ADN, así como en la correlación entre la cantidad de ADN observada en la qPCR y el perfil genético que se obtiene posteriormente. En el Capítulo 4, sobre la amplificación de ADN, se compararon kits de STRs autosómicos (Globalfiler™, PowerPlex® Fusion 6C, e Investigator® 24Plex QS), STRs del cromosoma Y (Yfiler™ Plus, PowerPlex® Y23, e Investigator® Argus Y-28), explorándose también la aplicación de un kit de INNULs (InnoTyper® 21) comparando su poder de discriminación con el de un kit de STRs autosómicos (Globalfiler™). Si bien no se observaron diferencias significativas entre los kits de STRs autosómicos, sí se vieron diferencias en términos de mayor número de marcadores obtenidos del kit PowerPlex® Y23 con respecto a los otros. El kit de INNULs obtuvo un mayor número de marcadores que el kit de STRs autosómicos, teniendo, no obstante, un menor poder de discriminación. En el Capítulo 5 se revisan las técnicas de visualización de los resultados, así como el análisis de los perfiles genéticos de restos humanos críticos, y los cálculos estadísticos en los resultados de identificación. En el Capítulo 6, sobre la secuenciación de ADN, se exploró la aplicación de las técnicas de análisis de ADN antiguo en muestras forenses, realizándose en muestras analizadas con STRs autosómicos las técnicas de preparación de librería, shotgun sequencing, enriquecimiento con captura de ADN con el kit comercial Twist Bioscience, y deep shotgun. Finalmente, en el Capítulo 7, se revisan los diferentes puntos contenidos en la norma ISO 17025, sobre los requisitos de competencia de los laboratorios de ensayo, haciendo especial incidencia en los aspectos a tener en cuenta en un laboratorio de Genética forense.

The discovery in 1986 of the forensic applications of DNA analysis for identification purposes marked a revolution in the field of forensic sciences, establishing itself as one of the most accepted disciplines by courts worldwide. However, despite numerous advances that have enriched the discipline, such as PCR initially and more recently massively parallel sequencing, forensic genetics has not been without its challenges. These include DNA mixture analysis, low copy number DNA, or DNA degradation. In contexts such as organized crime, terrorism, disaster victim identification, or mass graves, DNA analysis on human remains often constitutes the only possible method for identification, given that bones and teeth are the only biological remain that endure over time. These types of samples pose challenges for forensic genetics laboratories due to their low DNA quantity and DNA degradation. Additionally, the distant familial relationship between human remains and reference family members for eventual comparisons can complicate identification efforts, especially in situations in which the incident and identification actions are widely separated in time. Therefore, optimizing and fine-tuning protocols for the analysis of degraded human remains to achieve maximum efficiency in obtaining a genetic profile is of special interest to the discipline. The Laboratory of Genetic Identification at the University of Granada, initially with the Phoenix program and more recently through an agreement with the Andalusian government for the identification of victims from the Spanish Civil War and post-war period, possesses extensive experience in analysing critical human remains. This laboratory served as the crucible for conducting this doctoral thesis, contributing both its prior and current experience, as well as the availability of samples for the various analyses conducted. The objective of this doctoral thesis is the optimization of DNA analysis, in the forensic context, for critical human remains (bones and teeth). To achieve this, a review of the different stages of DNA analysis was conducted: sampling of bone/teeth remains, extraction, quantification, amplification, sequencing, results visualization, and reporting. The review also considered guidelines to ensure process quality within the framework of ISO 17025 standards. For each analytical stage, a comparison of different available analytical techniques was attempted, seeking the one that showed the best performance for each stage: In Chapter 1, concerning bone or teeth samples, the performance of DNA analysis was compared in different human remains from the same individual: femur, tibia, teeth, and petrous bone. It was observed that both teeth and the petrous bone, especially the latter, are generally the best substrates for obtaining a genetic profile. In Chapter 2, regarding DNA extraction, five different extraction protocols were compared: organic extraction, silica in suspension, silica on a column, and with commercial kits PrepFiler™ BTA and InnoXtract™. It was found that the organic extraction protocol with phenol/chloroform/isoamyl alcohol had the best performance in terms of quantification and obtained genetic profile. In Chapter 3, about DNA quantification, the efficiency of four commercial qPCR kits was compared: Quantifiler™ Trio, PowerQuant™, Quantiplex® Pro, and InnoQuant™ HY. The latter kit stood out in terms of sensitivity in detecting DNA, as well as the correlation between the amount of DNA observed in qPCR and the genetic profile obtained subsequently. In Chapter 4, concerning DNA amplification, autosomal STRs commercial kits (Globalfiler™, PowerPlex® Fusion 6C, and Investigator® 24Plex QS), Y-STRs commercial kits (Yfiler™ Plus, PowerPlex® Y23, and Investigator® Argus Y-28), and the application of an INNULs kit (InnoTyper® 21) were compared, also comparing its discrimination power with an autosomal STR kit (Globalfiler™). While no significant differences were observed between autosomal STR kits, differences were seen in terms of a higher number of markers obtained from the PowerPlex® Y23 kit compared to the others. The INNULs kit obtained a higher number of markers than the autosomal STR kit, albeit with lower discrimination power. Chapter 5 reviews the different visualization techniques, genetic profile analysis of critical human remains, and statistical calculations in identification results. In Chapter 6, on DNA sequencing, the application of ancient DNA analysis techniques on forensic samples was explored. Techniques such as library preparation, shotgun sequencing, DNA capture enrichment with the commercial kit Twist Bioscience, and deep shotgun were performed on samples analyzed with autosomal STRs. Finally, in Chapter 7, the different recommendations contained in ISO 17025 standards regarding the competence requirements of testing laboratories are reviewed, with a particular emphasis on aspects to consider in a forensic genetics laboratory.