Mejora de la Inmunoterapia CAR frente a neoplasias tipo B refractarias mediante edición genómica

Abstract

La terapia celular adoptiva (TCA) con células T genéticamente modificadas que expresan receptores antigénicos quiméricos (CAR) ha surgido como una opción prometedora para pacientes con leucemia o linfoma refractario. A pesar de su éxito en malignidades de tipo B, la terapia con células CAR-T aún enfrenta desafíos como la toxicidad, la inactivación por el microentorno tumoral (TME) y una baja persistencia celular en los pacientes. En este sentido, el eje PD1/PD-L1 juega un papel crucial en muchos tipos de tumores. Por lo tanto, el objetivo principal de esta tesis doctoral es el desarrollo de una estrategia de edición genómica (EG) que permita generar células CAR-T capaces de superar los frenos generados por la expresión de PDL1 en las células tumorales. El primer abordaje fue eliminar PD-1 en las células CAR-T y realizar un estudio en detalle de sus características fenotípicas y metabólicas. El CAR utilizado en esta tesis doctoral, el CAR ARI-0001, proviene de una colaboración con el Dr. Manel Juan y es un CAR de segunda generación específico para CD19. Para llevar a cabo la eliminación de PD-1 en estas células CAR-T, realizamos la edición genómica del exón 1 mediante el sistema CRISPR/Cas9, entregado como ribonucleoproteína (RNP). Mediante esta estrategia, hemos obtenido una depleción altamente eficiente (80%) de PD-1 sin alteraciones significativas en el fenotipo de las células T y sin generación de grandes deleciones. Tras realizar las caracterizaciones celulares y metabólicas de las células CAR-T PD-1 KO, los datos muestran que la edición de PD-1 da lugar a una capacidad proliferativa reducida junto a una menor capacidad respiratoria disponible (SRC), indicador del potencial oxidativo máximo de la mitocondria disponible para la producción de energía. Sin embargo, a su vez, está induciendo a los linfocitos T hacia poblaciones memoria. Además, estas células CAR-T PD-1 KO presentan una mayor persistencia y eficiencia lítica cuando son co-cultivadas con las células tumorales diana expresoras de PD-L1 en comparación con las células CAR-T WT, aunque la expresión de los marcadores de agotamiento permanece invariable tras estos experimentos. Estos datos sugieren que, aunque la edición de PD-1 mejora la capacidad de persistencia de las células CAR-T en presencia de PD-L1 provoca, a su vez, una reducción del fitness (capacidad proliferativa y empeoramiento metabólico) que deben ser mejorados. En base a estos resultados propusimos que, además de eliminar PD-1, necesitábamos una expresión controlada de ciertos factores que mejoren el fitness celular, para lo cual nos centramos en la citocina IL-15. La interleucina-15 (IL-15) desempeña un papel crucial en la espuesta citotóxica contra células tumorales entre las que se encuentran la mejora de la proliferación y metabolismo de las células T. Sin embargo, debido a su alta actividad biológica en múltiples dianas, es importante controlar su expresión. Nos propusimos, por tanto, generar una plataforma basada en CRISPR/Cas9 – recombinación homóloga (HDR) para expresar el gen de interés (IL-15, otras citocinas, anticuerpos, etc) en el locus PDCD1. Esto podría permitir no sólo eliminar PD-1, sino expresar genes que potenciaran aún más la actividad de las células CAR-T. Además, estos genes potenciadores se expresarían siguiendo el patrón del gen PDCD1, consiguiendo de esta manera una expresión controlada de la misma, evitando los efectos negativos derivados de una expresión constitutiva. Para llevar a cabo este objetivo, en primer lugar, se evaluaron diferentes estrategias de entrega del ADN donador (IDLVs, AAVs, ADN-productos de PCR y ADNcs) e incluso se realizaron diferentes optimizaciones de los IDLVs utilizando un donador expresando el gen reportero eGFP a través de un promotor fuerte y dirigido a un locus (TRAC) que nos permitiera evaluar la eficacia y seguridad fácilmente. Los resultados mostraron que los AAV6 son los mejores vectores para entregar los ADN donadores a las células T primarias, con eficiencias que rondaban el 60% de integraciones específicas en el producto pdTRUCKIL-15 generado. Por lo tanto, se concluyó que la plataforma para generar estos CAR-T PD-1 KO de 4ª generación sería mediante el uso de RNPs para entregar la endonucleasa CRISPR/Cas9 y AAV6 para entregar el ADNc de IL-15 en el locus PDCD1 para generar células pdTRUCKIL-15. Una vez generadas las células pdTRUCKIL-15 determinamos que, tal y como era esperado, IL-15 se expresaba siguiendo el perfil de expresión de PD-1. Además, evaluamos el impacto de la eliminación de PD-1 junto con la expresión controlada de IL-15 en el fenotipo, la proliferación, la capacidad respiratoria, expresión de proteínas anti-apoptóticas y la actividad lítica de las células pdTRUCKIL-15. Nuestros resultados demostraron en todos los casos que la expresión de IL-15 revierte por completo la deficiencia proliferativa de las células CAR-T PD-1 KO, observándose una disminución en la expresión de BIM (proteína pro-apoptótica) y un aumento en la expresión de Bcl-xL (proteína anti-apoptótica). Por otro lado, el producto pdTRUCKIL-15 muestra un incremento en las poblaciones memoria además de características metabólicas mejoradas en términos de SRC respecto de las células CAR-T PD-1 KO. Además, las células pdTRUCKIL-15 presentaron una mayor capacidad lítica que las células CAR-T PD-1 KO y CAR-T WT cuando son co-cultivadas con las células diana PD-L1+, aunque la diferencia es significativa únicamente frente a las células CAR-T WT. En resumen, en esta tesis doctoral hemos demostrado que la eliminación de PD-1 en las células CAR-T mejora su actividad lítica frente a células tumorales PD-L1+, pero además puede reducir su potencial metabólico y su actividad proliferativa. Sin embargo, hemos demostrado que la expresión controlada de IL-15 revierte estas dos deficiencias, confiriendo a las células pdTRUCKIL-15 una mayor capacidad para resistir las condiciones desafiantes del microentorno tumoral, asegurando su supervivencia y persistencia prolongadas. En última instancia, esta estrategia presentada como una plataforma de edición genómica para generar TRUCKS PD-1 KO, representa un avance significativo en la ingeniería de células CAR-T, allanando el camino para futuras terapias más efectivas y duraderas en el tratamiento de la leucemia, el linfoma y otras malignidades hematológicas refractarias.

Adoptive Cell Therapy (ACT) with genetically modified T cells expressing Chimeric Antigen Receptor (CAR) has emerged as a promising option for patients with refractory leukemia or lymphoma. Despite its success in B-cell malignancies, CAR-T cell therapy still faces challenges such as toxicity, inactivation by the tumour microenvironment (TME), and low cell persistence in patients. In this context, the PD-1/PD-L1 axis plays a crucial role in various tumour types. The main aim of this Doctoral Thesis is to develop a gene editing (GE) strategy to generate CAR-T cells capable of overcoming inhibitory signals induced by PD-L1 expression in tumor cells. The initial approach involved PD-1 deletion in CAR-T cells, with a detailed characterization of their phenotypic and metabolic features. The CAR utilized in this Thesis, CAR ARI-0001, is a second-generation CAR specific for CD19, developed in collaboration with Dr. Manel Juan. PD-1 elimination was achieved through CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) delivery targeting exon 1 of PDCD1 gene. The study demonstrates that CRISPR/Cas9 delivered as RNP enables highly efficient PD-1 depletion (80%) without significant alterations in T cell phenotype or generating large deletions. Subsequent cellular and metabolic characterizations of CAR-T PD- 1 KO cells revealed a reduced proliferative capacity and lower available respiratory capacity (SRC), indicating a decreased mitochondrial oxidative potential. However, PD-1 editing induced T cells toward memory populations. Additionally, CAR-T PD-1 KO cells exhibited enhanced persistence and cytotoxicity capacity when were co-cultured with PD-L1-expressing target tumor cells compared to CAR-T WT cells, although expression of exhaustion markers remained consistent. These findings suggest that while PD-1 editing improves CAR-T cell persistence in the presence of PD-L1, it simultaneously induces a fitness reduction (proliferative capacity and metabolic impairment) that needs to be improved. Based on these results, it was proposed that, in addition to PD-1 elimination, controlled expression of some soluble factors enhancing fitness is needed like an additional step in the GE strategy, focusing on the cytokine IL-15. IL-15 plays a crucial role in the cytotoxic response against tumor cells, including improving T cell proliferation and metabolism. Due to its high biological activity across multiple targets, controlling its expression is essential. Therefore, a CRISPR/Cas9 – Homology-Directed Repair (HDR) platform was aimed at expressing a gene of interest (IL-15, other cytokines, antibodies, etc.) at the PD-1 locus. This platform could allow not only PD-1 abrogation but also the expression of genes further enhancing CAR-T cell activity. Additionally, these enhancing genes would be expressed following the PD-1 gene pattern, ensuring a controlled expression and avoiding the negative effects from constitutive expression. To achieve this objective, various DNA donor delivery strategies (IDLVs, AAVs, PCR product DNA, and ADNcs) were evaluated, and optimizations of IDLVs were performed using an eGFP-expressing donor through a strong promoter directed to a locus (TRAC). The results showed that AAV6 was the most efficient vector for delivering DNA donors to primary T cells, with efficiencies around 60% for specific integrations in the generated pdTRUCKIL-15 T cell product. Consequently, the platform for generating these 4th generation CAR-T PD-1KO would use RNPs for CRISPR/Cas9 delivery and AAV6 for IL-15 ADNc delivery to PDCD1 locus to generate pdTRUCKIL-15 cells. Once pdTRUCKIL-15 cells were generated, it was determined that IL-15 expression followed the PD-1 expression profile. Furthermore, the impact of PD-1 deletion and controlled IL-15 expression on the phenotype, proliferation, respiratory capacity, anti-apoptotic proteins, and lytic activity of pdTRUCKIL-15 cells was evaluated. Results demonstrated that IL-15 expression completely reversed the proliferative deficiency of CAR-T PD-1 KO cells, with a decrease in BIM (pro-apoptotic protein) expression and an increase in Bcl-xL (anti-apoptotic protein) expression. Moreover, pdTRUCKIL-15 cells exhibited an increase in memory populations together with and improved metabolic characteristics in terms of SRC rates (a crucial feature for longevity, persistence, and effective lytic function) compared to CAR-T PD-1 KO cells. Additionally, pdTRUCKIL-15 cells showed higher lytic capacity than CAR-T PD-1 KO and CAR-T WT cells, although the difference was significant only against CAR-T WT cells. In summary, this Thesis demonstrates that PD-1 deletion in CAR-T cells enhances their activity against PD-L1+ tumour cells but may also reduce their metabolic potential and proliferative activity. Furthermore, controlled expression of IL-15 reverses these two deficiencies, endowing pdTRUCKIL-15 cells with a greater ability to withstand the challenging conditions of the tumor microenvironment, ensuring a prolonged survival and persistence. Ultimately, the presented strategy as a genomic editing platform to generate PD-1 KO TRUCKS represents a significant advance in CAR-T cell engineering, paving the way for more effective and durable therapies in the treatment of leukemia, lymphoma, and other refractory hematologic malignancies.