Preclinical study of the antitumor effect of melatonin in different head and neck cancer models: evaluation of the role of mitochondria and oxidative stress

Abstract

El carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) es el sexto cáncer más común a nivel mundial, con casi 500.000 muertes cada año. El tratamiento actual del HNSCC es la combinación de cirugía, quimioterapia y radioterapia local. Sin embargo, estos tratamientos presentan importantes efectos secundarios y es frecuente el desarrollo de resistencia frente a los mismos, lo que conduce al fallo de las terapias y a la muerte del paciente. Por tanto, es necesario el desarrollo de nuevas terapias con mayor eficacia y menores efectos adversos que los tratamientos ya existentes. En el desarrollo de terapias innovadoras destaca la melatonina, ya que carece de efectos secundarios y posee importantes efectos oncostáticos. Numerosos estudios han demostrado que la melatonina no solo potencia los efectos de los tratamientos existentes, sino que, además, reduce la toxicidad de estos. Esto se debe a que la melatonina tiene un efecto dual, disminuyendo el estrés oxidativo en las células sanas y aumentándolo en las células tumorales, donde, además, presenta efectos antiproliferativos, pro-apoptóticos, anti-angiogénicos y anti-metastásicos. Sin embargo, a pesar de los numerosos estudios que demuestran los efectos anti-tumorales de la melatonina, existen resultados contradictorios cuando se utiliza en modelos in vivo. Una posible causa podría ser que, para ejercer sus efectos oncostáticos, son necesarios niveles altos de melatonina en el tumor, siendo, por tanto, necesaria la búsqueda de una ruta de administración alternativa que permita aumentar la disponibilidad de la melatonina en el tumor y así establecer un tratamiento efectivo. Por otro lado, un factor determinante en el fallo de los ensayos clínicos es el modelo preclínico empleado. Tradicionalmente, las líneas celulares ya establecidas han sido la herramienta más utilizada en la investigación contra el cáncer. Sin embargo, tras años en cultivo, la composición genética y el comportamiento de estas células se encuentra alterada y, como consecuencia, no son una representación real de los tumores de los pacientes. Para solventar este problema, en los últimos años se han desarrollado los modelos preclínicos derivados de pacientes, que proceden directamente de tumores de pacientes y, por tanto, mantienen la heterogeneidad y las características moleculares de los mismos. Estos modelos son más adecuados para estudiar la efectividad de los diferentes tratamientos y, por ello, en los últimos años ha aumentado significativamente su uso. Sin embargo, los estudios de melatonina en modelos derivados de pacientes son prácticamente inexistentes. Por tanto, nuestra hipótesis es que la melatonina, debido a sus propiedades oncostáticas demostradas in vitro, podría ser un agente prometedor como nuevo tratamiento frente al HNSCC o como terapia adyuvante de las terapias ya existentes. Sin embargo, es necesario el desarrollo de una nueva formulación o vía de administración que permita alcanzar altos niveles de melatonina en el tumor, necesarios para ejercer sus efectos oncostáticos. Estos estudios, además, deben desarrollarse no solo en los modelos preclínicos tradicionales sino también en los modelos derivados de pacientes, facilitando así la traslación a la clínica. Para ello, el objetivo de este estudio ha sido analizar los efectos de diferentes formulaciones de melatonina in vivo, en diferentes modelos de ratones con xenoinjertos de células HNSCC. Analizamos los efectos de la melatonina en ratones con xenoinjertos de células Cal-27 y SCC-9, dos líneas celulares ya establecidas de HNSCC, y en ratones con xenoinjertos de tumores procedentes de pacientes. Estos ratones se trataron con diferentes formulaciones de melatonina, administrada intratumoralmente cada 24 horas durante 63 días. La melatonina fue administrada sola o en combinación con cisplatino (CDDP), uno de los tratamientos actuales más empleados frente al HNSCC. Tras sacrificar los animales, se analizaron histológicamente los tumores para evaluar los efectos oncostáticos de la melatonina. También se analizaron la morfología y distribución de las mitocondrias, los niveles de ROS y la apoptosis. Además, se estudiaron los efectos de la melatonina en el proceso de migración, tanto en las líneas celulares ya establecidas como en células tumorales procedentes del tumor de un paciente. Los resultados demostraron que la administración intratumoral de melatonina al 3% redujo el crecimiento tumoral en ratones con xenoinjertos de células Cal-27 y SCC-9, lo que se correlacionó con un aumento significativo de los niveles de melatonina en el tumor. El análisis histológico de los tumores tratados con melatonina confirmó una disminución de las áreas tumorales activas y mostró un aumento de la cápsula de colágeno que rodea al tumor, así como una diminución de las áreas adenoescamosas, lo cual se ha relacionado con un mejor pronóstico del cáncer. Además, la administración intratumoral de melatonina potenció los efectos del CDDP en cuanto a reducción del tumor. En concordancia con estos resultados, la melatonina aumentó los niveles de LPO y de proteínas oxidadas, tanto sola como en combinación con CDDP, e incrementó significativamente la apoptosis en los tumores Cal-27. La melatonina al 3% también redujo los niveles de CD98, lo que sugiere un incremento de la diferenciación de las células tumorales. Por otro lado, teniendo en cuenta que una de las principales dianas de la melatonina es la mitocondria, estudiamos la morfología y la distribución de las mitocondrias mediante microscopía electrónica. Las imágenes obtenidas mostraron que las mitocondrias de los tumores tratados eran más grandes y se encontraban en la periferia de las células y no alrededor del núcleo, lo que se ha relacionado con un mejor diagnóstico. A continuación, se desarrollaron modelos celulares y de xenoinjertos derivados de pacientes a partir de biopsias de HNSCC. Los resultados demostraron que la melatonina redujo la proliferación celular y la formación de esferoides en el modelo celular y, además, disminuyó drásticamente el crecimiento tumoral en los ratones con tumores primarios, procedentes de pacientes en los 3 modelos analizados. Finalmente, se demostró que la melatonina redujo la migración y las propiedades invasivas de las líneas celulares Cal-27 y SCC-9, además de alterar la expresión de los marcadores de transición epitelio-mesénquima en el modelo celular derivado de paciente. Como conclusión, nuestro estudio ha elucidado el papel de la melatonina en la reducción del crecimiento tumoral, tanto sola como en combinación con CDDP, proponiendo la melatonina como una posible opción terapéutica frente al cáncer. Concretamente, la combinación de CDDP y melatonina podría ser un tratamiento prometedor en la terapia frente al HNSCC, abriendo la puerta a un futuro ensayo clínico con pacientes oncológicos para establecer un tratamiento con melatonina con aplicación clínica.

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is an aggressive malignancy, representing the sixth most common cancer worldwide and accounting for nearly 500,000 deaths every year. Current mainstay HNSCC treatment is the combination of surgery, cisplatin (CDDP)-based chemotherapy and concurrent locoregional radiotherapy. However, these treatments are associated with important related-toxicities and the development of resistance, leading to treatment failure and to the death of patients. The poor outcomes for HNSCC demonstrate the need for novel therapies with less toxicity and more efficacy. Because of its oncostatic influence and lack of association with adverse effects, melatonin is of relevance to the development of innovative cancer treatments. Several studies have demonstrated that melatonin not only shows synergistic anticancer activity with other treatments, but also reduce the general toxicity arising from other treatments. This could be due to the “dual effect” of melatonin. On one hand, melatonin protects normal cells from a variety of insults due to its antioxidant effect in these cells, and on the other, melatonin suppresses tumor cell growth due to its pro-oxidant effect in these cells. Its oncostatic properties include pro-oxidant, anti-proliferative, pro-apoptotic, anti-angiogenic and antimetastatic actions in tumor cells. Nevertheless, although a great deal of clinical evidence has confirmed the anticancer effects of melatonin, some conflicting results also exist when it is applied in vivo. One possible explanation is that high concentrations of melatonin within the tumor are necessary to exert its oncostatic effect, being therefore necessary to search for an alternative administration route to improve bioavailability and establish the optimal dosage for cancer treatment. On the other hand, an important factor for failure in clinical trials is the inadequate biology of preclinical models. Traditionally, established human cancer cell lines have been the fundamental tool in cancer research. However, the genetic composition and behavior of established cancer cell lines has been altered after thousands of generations in culture, not faithfully representing real patient´s tumors. To solve this problem, the concept of patient-derived models emerged and gained extensive acceptance in cancer research. Since they proceed directly and recently from a patient´s tumor, these models might better retain the heterogeneity and molecular characteristics of patient tumors and be a better alternative to study cancer biology and drug sensitivity. Therefore, the utilization of patient-derived models significantly increased in the recent 5 years. However, literature about the oncostatic effect of melatonin in patient-derived tumor models is scant. Considering all above, our hypothesis is that melatonin, due to its oncostatic properties, is a promising agent in anticancer therapy, as new therapeutic approach and as a coadjutant therapy in HNSCC treatment. However, to establish a melatonin treatment with proper application in clinical practice, it is necessary to search for an alternative formulation or an alternative route of administration, which ensures a high bioavailability of melatonin in the tumor. These studies should be conducted not only in established HNSCC cell line models, but also in patient-derived models, which further resemble real tumors and ensure clinical translation. Concerning this hypothesis, the general objective of this study was to analyze the effect of different formulations of melatonin in vivo in different HNSCC mice models. We analyzed the effect of melatonin in mice bearing established HNSCC Cal-27 and SCC-9 cell line xenografts or patient-derived tumor xenografts. Mice were treated with different formulations of melatonin, administered intratumorally each 24 hours for 63 days. Melatonin was administered alone or in combination with CDDP, one of the most common HNSCC treatment. After mice sacrifice, tumors were histologically analyzed to assess the oncostatic effects of melatonin. Mitochondria morphology and distribution, apoptosis and ROS levels were also measured in tumors. Finally, melatonin effects in migration process were also studied, both in established and patient-derived cells. Results showed that intratumoral treatment with melatonin 3% reduced tumor growth in Cal-27 and SCC-9 xenografts, which correlated with a significant increase of melatonin levels in the tumors. The histology of tumors treated with intratumoral melatonin showed a decrease in tumor active areas, as well as an increase in collagen-rich capsule surrounding the tumors and a reduction of adenosquamous differentiation areas, which has been associated with a better cancer prognosis. Intratumoral injection of melatonin also potentiated the effects of CDDP reducing tumor growth. In line with these results, melatonin increased LPO levels and oxidized protein expression in Cal-27 tumors, alone or in combination with CDDP, and noticeably triggered ROS-dependent apoptosis, which resulted in an increase in the Bax/Bcl-2 ratio and TUNEL-positive nuclei. Moreover, melatonin 3% reduced CD98 levels compared to the control and CDDP groups, suggesting an increase in tumor cell differentiation. On the other hand, considering that one of the main targets of melatonin is the mitochondria, we evaluated mitochondrial morphology and distribution by electron microscopy. According to previous in vitro results, in melatonin-treated tumors, mitochondria were larger and localized in the periphery of the cells and not in the perinucleus, which has been associated with a better cancer outcome. Next, it was attempted to generate patient-derived cells (PDC) and patient-derived xenografts (PDX) from HNSCC tumor biopsies. Results demonstrated that melatonin reduced cell proliferation and spheroid formation in the PDC model. In addition, the intratumoral administration of melatonin 3% reduced tumor growth in the three PDXs analyzed. Finally, it was demonstrated that melatonin impaired migration and invasive capacities of Cal-27 and SCC-9 cell lines, as well as altered epithelial to mesenchymal transition markers in the PDC model. As a conclusion, our study elucidated the roles of intratumoral melatonin reducing tumor growth and synergizing CDDP, proposing melatonin as a possible therapeutic option for cancer treatment. Specifically, the combined treatment with melatonin and CDDP may be a promising clinical approach to treat patients with HNSCC, encouraging a future clinical trial in cancer patients to establish a new melatonin treatment with proper clinical application.