Connection between clock gene desynchronization and mitochondrial dysfunction in head and neck squamous cell carcinoma: evaluation of melatonin effects

Abstract

Los ritmos circadianos son un sistema regulador, con una periodicidad aproximada de 24 h, que genera cambios rítmicos en muchos procesos fisiológicos, mentales y conductuales en el organismo. En la actualidad son cada vez hay más las pruebas que vinculan la cronodisrupción (alteración de los ritmos circadianos) con una funcionalidad aberrante en la expresión de los genes del reloj, lo que da lugar a múltiples enfermedades entre las que se incluye el cáncer. El carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) es uno de los cánceres más comunes a nivel global. Además, a pesar de los avances en las técnicas de diagnóstico y en los tratamientos, la tasa de supervivencia continúa siendo del 60%, debido ello a la resistencia a fármacos y a la recurrencia. Por esta razón, se evidencia la necesidad en la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas y fármacos frente a este tipo de tumores. Una posible diana terapéutica son las mitocondrias debido a su papel crítico para el crecimiento tumoral y la metástasis. Su biogénesis y actividad se encuentra estrechamente regulada por los ritmos circadianos mediante el control de los genes reloj. Incluso, en los últimos años se ha demostrado que la fosforilación oxidativa regula la expresión de genes reloj clave, por lo que se establece un complejo circuito de retroalimentación entre la bioenergética celular y el mecanismo de relojería molecular. La melatonina, cuya producción y secreción oscila según el ciclo de luz-oscuridad, es el principal regulador de la maquinaria circadiana. Además, los efectos oncostáticos de la melatonina se correlacionan con un aumento de la actividad mitocondrial. Sin embargo, los vínculos directos entre la expresión del gen del reloj circadiano, la actividad mitocondrial y los efectos antiproliferativos de la melatonina en los cánceres, incluido el HNSCC, siguen siendo en gran medida desconocidos. Por esta razón, el objetivo de este estudio fue analizar la conexión entre la desincronización de genes del reloj y la disfunción mitocondrial en células cancerosas escamosas de cabeza y cuello, y analizar los efectos de la melatonina en estas células. Para ello analizamos los efectos de la melatonina en líneas celulares HNSCC (Cal- 27 y SCC9), que fueron tratadas con melatonina 500 y 1000 μM, en la expresión de los genes reloj Bmal1 y Per2, así como en Sirt1, regulado de forma circadiana, el cual juega un papel clave en el metabolismo mitocondrial. Además, estudiamos el efecto de esta hormona en el consumo de oxígeno mitocondrial mediante electro de Clark. En este trabajo descubrimos que la melatonina a altas dosis regula, de forma circadiana la expresión de los genes Per2 y Sirt1. A su vez, demostramos que los efectos antiproliferativos de la melatonina no están mediados por el gen reloj Bmal1. Sorprendentemente, el efecto resincronizador de la melatonina sobre Per2 y Sirt1 no produjo alteraciones en la oscilación de la actividad respiratoria mitocondrial. Por lo tanto, estos resultados permiten aumentar nuestra comprensión de los oncostáticos en el cáncer de cabeza y cuello, poniendo el foco en los efectos de esta hormona sobre la maquinaria circadiana. Además, esta investigación permite expandir los conocimientos actuales de los posibles mecanismos antiproliferativos de la melatonina en el tratamiento del HNSCC sugiriendo que sus efectos antiproliferativos son independientes de uno de los principales genes reloj, Bmal1.

Circadian rhythms are a regulatory system, with an approximate periodicity of 24 hours, that generates rhythmic changes in many physiological, mental and behavioral processes in the body. There is now increasing evidence linking chronodisruption (alteration of circadian rhythms) with aberrant functionality in the expression of clock genes, which gives rise to multiple diseases, including cancer. Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is one of the most common cancers globally. Furthermore, despite advances in diagnostic techniques and treatments, the survival rate continues to be 60%, due to drug resistance and recurrence. For this reason, the need is evident in the search for new therapeutic targets and drugs against this type of tumors. A possible therapeutic target is mitochondria due to their critical role for tumor growth and metastasis. Its biogenesis and activity is closely regulated by circadian rhythms through the control of clock genes. In recent years, it has even been shown that oxidative phosphorylation regulates the expression of key clock genes, establishing a complex feedback loop between cellular bioenergetics and the molecular clockwork mechanism. Melatonin, whose production and secretion oscillate according to the light-dark cycle, is the main regulator of the circadian machinery. Furthermore, the oncostatic effects of melatonin are correlated with an increase in mitochondrial activity. However, direct links between circadian clock gene expression, mitochondrial activity, and the antiproliferative effects of melatonin in cancers, including HNSCC, remain largely unknown. For this reason, the objective of this study was to analyze the connection between clock gene desynchronization and mitochondrial dysfunction in head and neck squamous cancer cells, and to analyze the effects of melatonin on these cells. To do this, we analyzed the effects of melatonin in HNSCC cell lines (Cal-27 and SCC9), which were treated with 500 and 1000 μM melatonin, on the clock genes Bmal1 and Per2, as well as on the circadian-regulated Sirt1, which plays a key role in mitochondrial metabolism. In addition, we studied mitochondrial oxygen consumption using Clark electrode. In this work, we discovered that melatonin at high doses regulates the expression of the Per2 and Sirt1 genes in a circadian manner. In turn, we demonstrate that the antiproliferative effects of melatonin are not mediated by the clock gene Bmal1. Surprisingly, the resynchronizing effect of melatonin on Per2 and Sirt1 did not produce alterations in the oscillation of mitochondrial respiratory activity. Therefore, these results allow us to increase our understanding of oncostatics in head and neck cancer, focusing on the effects of this hormone on the circadian machinery. Furthermore, this research allows us to expand the current knowledge of the possible antiproliferative mechanisms of melatonin in the treatment of HNSCC, suggesting that its antiproliferative effects are independent of one of the main clock genes, Bmal1.