Analysis of Functional Annotations in Regulatory Elements

Abstract

The progress in high-throughput techniques, characterised by enhanced measurement accuracy and affordability, has significantly contributed to our improved comprehension of biological systems at the molecular level. This development has propelled the advancement of omics biomedicine research, specially, facing the current challenges that complex diseases present. However, the high heterogeneity of complex diseases stresses the need of a personalised medicine and the integration of the different layers that regulate biological systems. The general purpose of these studies is to identify biomarkers inspecting the crosstalk between the different molecules that govern the genetic information flow. Commonly, the results of omics data investigation yield large lists of candidate biomarkers. Making sense out of these requires bioinformatics methodologies, particularly, the functional annotations enrichment analysis. It applies a statistical test to evaluate the overrepresentation of biological annotations within a list of biomarkers in comparison to a reference background. While it is a well established methodology for genes and proteins there is a notable lack of tools that enable the exploration of functional implications associated with regulatory elements. This thesis’s general objective is to address the existing gap contributing to the biomedical scientific community with a functional enrichment tool to analyse regulatory elements. After carefully reviewing the state-of-the-art enrichment methodologies for miRNAs, we learnt that miRNAs, as well as CpG methylation islands and transcription factors, have a common method that consists of inferring their functional implications through the annotations associated with their target genes. This is because the predominant functional terms databases are dedicated to genes and the annotations of regulatory elements are mainly describing their natural role and not their downstream functional effect on the target genes. In the concrete case of analysing the associated genes of CpGs and miRNAs, the traditional enrichment method which applies a test based on the central hypergeometric distribution over the associated genes produces biassed results towards specific and related functional terms mainly related with cell cycle, regulation processes and cancer. Current tools propose different solutions for the analysis of miRNAs and CpG islands. For instance, to avoid the traditional approach limitations in miRNAs, direct miRNAs set annotations must be tested which can be obtained either by expert curation or after transforming gene-based annotations to the miRNAs-level. Conversely, a well-established unbiased alternative for CpGs analysis employs the Wallenius noncentral hypergeometric test but, surprisingly, no miRNAs literature hinted about it. Our objective here is focussed on assessing and implementing a novel adaptation of the Wallenius method for the analysis of miRNAs. The novel method and the evaluation of other known methods for the unbiased functional enrichment analysis of regulatory elements has motivated the development of a new GeneCodis version. To fulfil this objective the new version required a complete reengineering of the application. As a result, GeneCodis 4 offers the latest required methods to perform functional enrichment analysis of lists of genes, proteins, CpGs, miRNAs and transcription factors. The update also provides an improvement of the co-annotation discovery algorithm, an expansion of the annotations and organisms database and new interactive visualisations. It is equally accessible for bioinformatics and bench scientists thanks to its implementation as a webtool with an application programming interface. Finally, almost no literature studies the enrichment analysis of transcription factors lists. In this context, the authors of the only tool to perform singular enrichment analysis of transcription factors, TFTenricher, appear to have overlooked the biassed enrichment analysis of regulatory elements. This presented an opportunity for us to demonstrate that the varying number of transcription factors per regulated gene contributes to the constant enrichment of signalling pathways, transcription regulation, cell cycle and cancer terms. Finally, we validated the power of the Wallenius approach in the transcription factors context by means of null simulations and two real cases reanalysis.

Los avances en las técnicas de alto rendimiento, caracterizadas por una mayor precisión y asequibilidad de las mediciones, han contribuido significativamente a mejorar nuestra comprensión de los sistemas biológicos a nivel molecular. Este desarrollo ha impulsado el avance de la investigación de las ómicas en biomedicina, especialmente, de cara a los retos actuales que plantean las enfermedades complejas. Sin embargo, la gran heterogeneidad de las enfermedades complejas acentúa la necesidad de una medicina personalizada y de la integración de las diferentes capas que regulan los sistemas biológicos. Estos estudios buscan identificar biomarcadores a partir de investigar la relación entre las distintas moléculas que gobiernan el flujo de información genética. Por lo general, los resultados de la investigación de datos ómicos producen grandes listas de biomarcadores candidatos. Para darles sentido se requieren metodologías bioinformáticas, en particular, el análisis de enriquecimiento de anotaciones funcionales. Éste método aplica una prueba estadística para evaluar la sobrerrepresentación de anotaciones biológicas dentro de una lista de biomarcadores en comparación con una referencia. Aunque el análisis de enriquecimiento funcional de genes y proteínas es una metodología establecida, existe una notable carencia de herramientas que permitan explorar las implicaciones funcionales asociadas a elementos reguladores. El objetivo general de esta tesis es abordar el vacío existente contribuyendo a la comunidad científica biomédica con una herramienta de enriquecimiento funcional para analizar listas de elementos reguladores. Tras revisar detenidamente el estado del arte de las metodologías de enriquecimiento para miARNs aprendemos que tanto estos como las islas CpG de metilación y factores de transcripción, tienen un método común que consiste en inferir sus implicaciones funcionales mediante las anotaciones asociadas a sus genes diana. Esto se debe a que las bases de datos de términos funcionales predominantes están dedicadas a los genes y las anotaciones de los elementos reguladores describen principalmente su papel natural y no su efecto funcional en los genes diana. En el caso concreto del análisis de los genes asociados a CpGs y miARNs, el método tradicional de enriquecimiento que aplica un test basado en la distribución hipergeométrica central sobre los genes asociados produce resultados sesgados hacia términos funcionales específicos y relacionados principalmente con el ciclo celular, los procesos de regulación y el cáncer. Las herramientas actuales proponen diferentes soluciones para el análisis de miARNs e islas CpG. Por ejemplo, para evitar las limitaciones del enfoque tradicional en miARNs, se deben testar las anotaciones del conjunto de miARNs, que se pueden obtener mediante la curación directa por expertos o tras transformar las anotaciones basadas en genes al nivel de miARNs. Por otro lado, una alternativa no sesgada para el análisis de CpGs emplea la distribución de Wallenius sobre la cual, sorprendentemente, ningún artículo sobre miARNs lo menciona. Nuestro objetivo aquí se centra en la evaluación y aplicación de una nueva adaptación del método de Wallenius para el análisis de miARNs. El nuevo método y la evaluación de otros conocidos para el análisis de enriquecimiento funcional no sesgado de elementos reguladores ha motivado el desarrollo de una nueva versión de GeneCodis. Para cumplir este objetivo, la nueva versión ha requerido una reingeniería completa de la aplicación. Como resultado, GeneCodis 4 ofrece los últimos métodos necesarios para realizar análisis de enriquecimiento funcional de listas de genes, proteínas, miARNs, CpGs y factores de transcripción. La actualización también proporciona una mejora del algoritmo de descubrimiento de co-anotaciones, una ampliación de la base de datos de anotaciones y organismos y nuevas visualizaciones interactivas. Es igualmente accesible para bioinformáticos y científicos de laboratorio gracias a su implementación como herramienta web con una interfaz de programación de aplicaciones. Por último, casi ninguna literatura estudia el análisis de enriquecimiento de listas de factores de transcripción. En este contexto, los autores de la única herramienta para realizar análisis de enriquecimiento singular de factores de transcripción, TFTenricher, parecen haber pasado por alto el análisis de enriquecimiento sesgado de elementos reguladores. Esto nos brindó la oportunidad de evaluar y demostrar que el número variable de factores de transcripción por gen regulado contribuye al enriquecimiento constante de términos de vías de señalización, regulación de la transcripción, ciclo celular y cáncer. Por último, hemos validado la potencia del enfoque de Wallenius en el contexto de los factores de transcripción mediante simulaciones nulas y el reanálisis de dos casos reales.