Desarrollo y evaluación de una técnica de quimioluminiscencia para la detección de antígeno de galactomanano de Aspergillus spp. en muestras biológicas
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Leyva Calero, AlbaEditorial
Universidad de Granada
Departamento
Universidad de Granada. Programa de Doctorado en Biología Fundamental y de sistemasDate
2023Fecha lectura
2023-08-08Referencia bibliográfica
Leyva Calero, Alba. Desarrollo y evaluación de una técnica de quimioluminiscencia para la detección de antígeno de galactomanano de Aspergillus spp. en muestras biológicas.Granada: Universidad de Granada, 2023. [ https://hdl.handle.net/10481/84685]
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Tesis Univ. Granada.Abstract
Las especies de los géneros Candida y Aspergillus son las causas más frecuentes de micosis invasivas.
Este tipo de infección afecta con mayor frecuencia a pacientes inmunodeprimidos, especialmente
pacientes oncohematológicos, con infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o
sometidos a tratamientos inmunosupresores, aunque puede afectar también a enfermos no
neutropénicos que han padecido infecciones virales (Influenza, SARS-CoV-2) o sometidos a procesos
quirúrgicos.
Aspergillus fumigatus, es la especie más frecuentemente implicada en la aspergilosis invasiva,
aunque otras especies del género Aspergillus también pueden producirla. Su diagnóstico es
extremadamente difícil, siendo necesario emplear todo tipo de técnicas de imagen y microbiológicas.
Las técnicas de tinción y cultivo presentan baja sensibilidad y, por otro lado, el tiempo de obtención
de los resultados es prolongado. La detección de anticuerpos en personas inmunodeprimidas es de
poca utilidad y las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos no han llegado a generalizarse por
condicionamientos técnicos.
Posiblemente, la técnica de mayor utilidad en diagnóstico, es la detección de antígeno de
galactomanano, por su sensibilidad y aparición precoz en las muestras biológicas. Es un
heteropolisacárido compuesto por un núcleo de manano no inmunogénico y cadenas laterales de
galactofuranosa inmunorreactivas que se encuentran en la pared celular de Aspergillus.
El objetivo de la presente investigación consistió en desarrollar un inmunoensayo enzimático de
captura tipo sandwich basado en quimioluminiscencia (CLIA), capaz de detectar el antígeno de
galactomanano en muestras biológicas, tanto de origen respiratorio como en suero. Un segundo
objetivo fue conseguir simplificar al máximo su ejecución, y que la duración de la prueba fuera lo
más reducida posible, en comparación con la técnica de inmunoenzimática (ELISA) convencional,
manteniendo los valores de sensibilidad y especificidad.
Para alcanzar estos objetivos se produjeron y purificaron antígenos de Aspergillus fumigatus y tras
la inmunización de murinos, se obtuvieron anticuerpos monoclonales reactivos frente a antígenos
de galactomanano purificados de distintos pesos moleculares, tanto aislados como asociados a
proteínas.
Estos anticuerpos monoclonales se caracterizaron mediante ensayos de avidez, isotipado,
reactividad e inhibición, y se seleccionó un clon que se empleó como anticuerpo de captura. Este
mismo anticuerpo se conjugó con peroxidasa y se empleó como anticuerpo detector. Se estudiaron
las condiciones idóneas para su fijación en la superficie de reacción, los diluyentes más adecuados
para el anticuerpo conjugado, junto con el resto de elementos que garantizaran una elevada
capacidad de discriminación entre las muestras negativas y positivas.
Para su comercialización, y con el objetivo de ser una herramienta de diagnóstico útil, se diseñó un
formato de monodosis automatizable, que permitiera un uso individualizado de la prueba, esencial
para poder disponer de una herramienta aplicable a situaciones de urgencia.
El estudio comparativo con la técnica de ELISA convencional, demostró un buen rendimiento
diagnóstico en el estudio interno de prestaciones (AUC = 0,944; Error estándar = 0,011 – 95% IC =
0,920-0,962). Se realizó un estudio externo en el que se encontraron valores equivalentes (AUC =
0,97; Error estándar = 0,014 – 95% IC = 0,945-0,985). Finalmente, se definió el punto de corte, que
señalaba el mejor límite para discriminar las muestras positivas de las negativas y conseguir optimizar
los valores de sensibilidad y especificidad. En el estudio externo, se analizaron un subgrupo de
muestras (N=120) con clasificación de aspergilosis invasiva probada/probable según los criterios
EORTC/MSG definidos en 2019. En este análisis se obtuvo una especificidad común para la técnica
CLIA y ELISA (100%), pero con una sensibilidad mayor para la técnica CLIA que para ELISA (80,9% y
63,2%, respectivamente). El grado de concordancia empleando el coeficiente kappa dio un grado de
acuerdo “sustancial” entre ambas técnicas en ambos estudios (к = 0,726 y к = 0,722,
respectivamente).
Además del análisis del rendimiento diagnóstico, se llevó a cabo el estudio del funcionamiento
analítico, el cual aportó información acerca de la precisión de la técnica, con valores de coeficiente
de variación (CV) < 10% para las muestras ensayadas con distinto grado de positividad; se constató
la ausencia de interferencias debidas a sustancias endógenas, capaces potencialmente de alterar los
resultados de este tipo de pruebas, a diversos fármacos que pueden provocar la aparición de
resultados falsos positivos y a anticuerpos anti-murinos (HAMA). Se estudió la vida útil del kit
desarrollado y se definió su estabilidad, conservado a 4°C, en 15 meses. Tanto en la técnica de ELISA
convencional, como en el nuevo desarrollo en CLIA, se obtuvo reactividad cruzada frente a otras
especies de hongos del género Aspergillus (A. niger, A. flavus y A. terreus), frente al género
Penicillium y frente a Histoplasma capsulatum.
Alcanzar tasas de sensibilidad y especificidad equivalentes a la técnica comercial ELISA, con una
duración de la técnica más reducida, su formato en monodosis y la automatización del proceso hacen
del kit de VirClia una herramienta idónea para el diagnóstico de aspergilosis invasiva.