Bio-preservation and bio-active compounds as sustainable strategies to improve quality and safety of fresh and fermented products

Abstract

Global projections reported that an increase in food demand of 35% will occur by 2030, mainly due to the population growth and economic development of emerging countries. In this perspective, a waste reduction in agro-food supply chains can be a fundamental strategy to guarantee environmental sustainability in food industry. This is possible through a valorisation of food residues, enhanced production yields and an extension of fresh food shelf-life. The increasing amount of food wastes is strongly related to the microbial spoilage, resulting in a loss of food quality and microbiological safety, especially in fresh or minimally processed products. The widespread consumers demand for natural and innovative foods directed the research towards the study of new “green” and environmentally friendly solutions, that need to be adapted to the specific characteristics of the different food products and processes. The development of sustainable approaches to assure safety, high quality and an increased shelf-life of both fresh and fermented products is a crucial aspect to pursue production efficiency and waste reduction. In particular, the attention has been focused on bio-preservation and bio-protection approaches, proposing, on the one hand, the use of natural antimicrobial compounds, and on the other, the application of microbial strains with antimicrobial properties toward pathogens and/or spoilage bacteria. In this latter case, nowadays, a limited number of commercial bio-protective and/or starter cultures are used to enhance product safety and quality. However, their application can cause product standardisation, with a loss in recognisability and peculiar features, linked to local productions. For this reason, an increased interest in traditional spontaneously fermented products as possible source of new autochthonous starter cultures or bio-protective strains for industrial purposes is emerging. Given these considerations, this PhD project, that is part of the European project BioProMedFood, financed in the frame of PRIMA – Section 2 Programme, was focused on the study of sustainable approaches to improve quality and microbiological safety of fresh or fermented meat products. With this purpose, three main strategies have been evaluated. The first concerned the valorisation of spontaneously fermented sausages microbial biodiversity, through the isolation of autochthonous microbial strains and their use as bio-protective or functional starter cultures in meat products. In particular, the work started with the characterisation of 15 traditional fermented sausages, collected in Mediterranean countries, addressed to highlight their microbial biodiversity by using metagenomic analysis. Lactic acid bacteria (LAB) and coagulase-negative cocci were the most representative microorganisms in all samples, but significant differences were observed in relation to the product characteristics and origin. More than 900 LAB strains were isolated from these traditional products and approx. 150 biotypes, mainly belonging to the species Latilactobacillus sakei, were detected. These results confirmed the high adaptation of this species to this ecological niche. These strains were studied regarding their antibiotic-resistances and amino biogenic potential and only safe strains (approx. 40) were characterised for their technological properties (growth performances at different salt concentrations and incubation temperatures) and their antimicrobial potential (inhibition of food-borne pathogens in vitro and the presence of genes related to bacteriocin production). The most promising strains were further studied for their anti-listerial activity in fresh sausages with promising results. In addition, they were used as starter cultures in the pilot plant production of fermented sausages. The results showed that the fermented sausages obtained with the selected strains were characterised by good aroma profiles and a reduced biogenic amine (BA) content. Moreover, the growth of Listeria monocytogenes during production and ripening, assessed with a challenge test, was strongly inhibited. The second aim of the work was focused on the use of natural compounds with antimicrobial potential, extracted from plant derivatives of species characterising the Mediterranean maquis. In particular, phenolic extracts and essential oils of Juniperus oxycedrus needles and Rubus fruticosus leaves were tested in vitro against a strain of List. monocytogenes and Enterococcus faecium, also by using a cytofluorimetric protocol to better evidence the effect on viability and physiological state of target cells. In the latter strain, the inhibition of tyramine production was also assessed to evaluate the plant derivatives potential in reducing the accumulation of this toxic BA. Data collected underlined relevant differences in relation to species and type of plant derivatives, but they hint at important possibilities for applications in specific foods or processes. The last topic of research of this thesis regarded the study of the effect of LAB fermentation on avocado leaves by-products. In particular, the attention was focused on the bio-availability of phenolic compounds in the plant extracts, caused by microbial metabolism. Even if the research work on this topic is still ongoing, the first data obtained are encouraging and an increase in antioxidant potential following LAB fermentation has been observed, even if in a strain-specific manner. Concluding, the work presented in this PhD thesis permitted to highlight the great potential of traditional meat products to be a reservoir of microbial biodiversity and a source of isolation of new strains with industrial importance. Moreover, the antimicrobial potential of compounds obtained from under-exploited plant matrices was also investigated to assess their possibility to serve as “green” strategies in the increase of fresh food safety. These aspects demonstrated the potential use of innovative biotechnological strategies, to pursue production efficiency and promote the sustainability of the entire production system from a circular economy perspective

Las proyecciones globales establecen que para el 2030se producirá un aumento en la demanda de alimentos del 35%, principalmente debido al crecimiento de la población y el desarrollo económico de los países emergentes. En esta perspectiva, una reducción de residuos en las cadenas de suministro agroalimentario puede ser una estrategia fundamental para garantizar la sostenibilidad ambiental en la industria alimentaria. Esto es posible a través de una valorización de los residuos de los alimentos, un mayor rendimiento de producción y una extensión de la vida útil de los alimentos frescos. La creciente cantidad de desperdicios de alimentos está fuertemente relacionada con el deterioro microbiano, lo que resulta en una pérdida de calidad de los alimentos y seguridad microbiológica, especialmente en productos frescos o mínimamente procesados. La demanda generalizada de alimentos naturales e innovadores por parte de los consumidores ha dirigido la investigación hacia el estudio de nuevas soluciones "verdes" y respetuosas con el medio ambiente, que deben adaptarse a las características específicas de los diferentes productos y procesos alimentarios. El desarrollo de estrategias sostenibles para garantizar la seguridad, la alta calidad y una mayor vida útil de los productos frescos y fermentados es un aspecto crucial para perseguir la eficiencia de la producción y la reducción de residuos. En particular, la atención se ha centrado en los enfoques de biopreservación y bioprotección, proponiendo, por un lado, el uso de compuestos antimicrobianos naturales y, por otro, la aplicación de cepas microbianas con propiedades antimicrobianas frente a patógenos y/o bacterias de deterioro. En este último caso, hoy en día, se utiliza un número limitado de cultivos comerciales bioprotectores y/o iniciadores para mejorar la seguridad y la calidad del producto. Sin embargo, su aplicación puede provocar la estandarización del producto, con una pérdida de identidad y características peculiares, vinculadas a las producciones locales. Por esta razón, está surgiendo un creciente interés en los productos tradicionales fermentados espontáneamente como posible fuente de nuevos cultivos iniciadores autóctonos o cepas bioprotectoras para fines industriales. Teniendo en cuenta estas consideraciones, este proyecto de doctorado, que forma parte del proyecto europeo BioProMedFood, financiado en el marco del Programa PRIMA – Sección 2, se centró en el estudio de enfoques sostenibles para mejorar la calidad y la seguridad microbiológica de los productos cárnicos frescos o fermentados. Con este propósito, se han evaluado tres estrategias principales. La primera está enfocada a la valorización de la biodiversidad microbiana de embutidos fermentados espontáneamente, mediante el aislamiento de cepas microbianas autóctonas y su uso como cultivos iniciadores bioprotectores o funcionales en productos cárnicos. En concreto, el trabajo se inició con la caracterización de 15 embutidos fermentados tradicionales, recogidos en países mediterráneos, dirigidos a poner de relieve su biodiversidad microbiana mediante el análisis metagenómico. Las bacterias lácticas (BAL) y los cocos coagulasa negativos (CNC) fueron los microorganismos más representativos en todas las muestras, pero se observaron diferencias significativas en relación con las características y el origen del producto. Se aislaron más de 900 cepas de BAL de estos productos tradicionales y se detectaron aproximadamente 150 biotipos, principalmente pertenecientes a la especie Latilactobacillus sakei. Estos resultados confirmaron la alta adaptación de esta especie a este nicho ecológico. Estas cepas se estudiaron en cuanto a su resistencia a los antibióticos y potencial amino biogénico y solo se caracterizaron cepas seguras (aproximadamente 40) por sus propiedades tecnológicas (rendimientos de crecimiento a diferentes concentraciones de sal y temperaturas de incubación) y su potencial antimicrobiano (inhibición de patógenos transmitidos por los alimentos in vitro y presencia de genes relacionados con la producción de bacteriocinas). Las cepas más prometedoras se estudiaron más a fondo por su actividad anti-Listeria en salchichas frescas con resultados prometedores. Además, se utilizaron como cultivos iniciadores en la producción en planta piloto de embutidos fermentados. Los resultados mostraron que los embutidos fermentados obtenidos con las cepas seleccionadas se caracterizaron por buenos perfiles aromáticos y un contenido reducido de aminas biógenas (AB). Además, se inhibió significativamente el crecimiento de Listeria monocytogenes durante la producción y maduración. El segundo objetivo del trabajo se centró en el uso de compuestos naturales con potencial antimicrobiano, extraídos de derivados vegetales de especies caracterizadoras de la maquia mediterránea. En particular, los extractos fenólicos y los aceites esenciales de agujas de Juniperus oxycedrus y hojas de Rubus fruticosus se probaron in vitro contra una cepa de List. monocytogenes y Enterococcus faecium, también mediante el uso de un protocolo citofluorimétrico para evidenciar mejor el efecto sobre la viabilidad y el estado fisiológico de las células diana. En esta última cepa, también se evaluó la inhibición de la producción de tiramina para evaluar el potencial de los derivados de la planta en la reducción de la acumulación de esta AB que es tóxica. Los datos recopilados pusieron manifiesto diferencias relevantes en relación con las especies y el tipo de derivados vegetales, evidenciando importantes posibilidades de aplicación en alimentos o procesos específicos. El último tema de investigación de esta tesis se centró en el estudio del efecto de la fermentación mediante BAL sobre las hojas de aguacate. En particular, la atención se centró en la biodisponibilidad de compuestos fenólicos en los extractos de estas hojas, como consecuencia del metabolismo microbiano. Los datos obtenidos son prometedores en cuanto se ha observado un aumento en el potencial antioxidante y en el contenido fenólicos de los extractos después de la fermentación mediante BAL, aunque de una manera específica de la cepa utilizada. Concluyendo, el trabajo presentado en esta tesis doctoral permitió poner de manifiesto el gran potencial de los productos cárnicos tradicionales para ser un reservorio de biodiversidad microbiana y una fuente de aislamiento de nuevas cepas con importancia industrial. Además, también se investigó el potencial antimicrobiano de compuestos obtenidos de matrices vegetales subexplotadas para evaluar su posibilidad de servir como estrategias "verdes" en el aumento de la seguridad de los alimentos frescos. Estos aspectos demostraron el uso potencial de estrategias biotecnológicas innovadoras para perseguir la eficiencia de la producción y promover la sostenibilidad de todo el sistema de producción desde una perspectiva de economía circular.