Generación de nuevos modelos de mucosa oral humana masticatoria y de revestimiento con biomateriales funcionalizados y fuentes celulares alternativas para su uso en terapias avanzadas

Abstract

Los trastornos de la mucosa oral humana como el cáncer oral, los traumatismos y las enfermedades periodontales, son afecciones muy prevalentes en la actualidad. El tratamiento de estas patologías depende en gran medida de la disponibilidad de mucosa oral humana sana que permita una terapia de sustitución, algo que dificulta su tratamiento debido a la escasez de donantes. En este sentido, la Ingeniería Tisular surge como una gran alternativa para el tratamiento de estas patologías, ya que es una rama de la medicina que tiene como objetivo básico la elaboración de tejidos artificiales que permitan la reparación restauración o incluso la mejora de las funciones de tejidos y órganos dañados. En la presente Tesis Doctoral en primer lugar se ha llevado a cabo la optimización de las propiedades biomecánicas del biomaterial de fibrina y agarosa, previamente desarrollado por el grupo de Ingeniería Tisular de la Universidad de Granada, con el objetivo de generar modelos mejorados de mucosa oral humana mediante protocolos de Ingeniería Tisular. En concreto, se han estudiado cinco tipos de agarosas diferentes y cada una de ellas a cuatro concentraciones, sobre las que se evaluaron las propiedades biomecánicas. Los modelos mejorados de mucosa oral humana permitirían el tratamiento clínico de afecciones que afectan a la mucosa oral humana. Sin embargo, la biointegración es un problema importante en la generación de estos tejidos artificiales, el cual podría verse favorecido por la generación de sustitutos con un mayor potencial de vascularización. En este sentido, en la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo una segunda optimización para la mejora de los procesos de biointegración a partir de la incorporación de células madre mesenquimales humanas (MSC) con capacidad de vascularización en el estroma de los sustitutos de mucosa oral humana, para así generar modelos mejorados de mucosa oral humana prevascularizados. En concreto, se han empleado MSC obtenidas a partir de tejido adiposo (ADSC), médula ósea (BMSC) y pulpa dental (DPSC). Los tres tipos de MSC fueron diferenciados a linaje endotelial utilizando medios inductores. Una vez inducida la diferenciación vascular se evaluó el potencial de vascularización de las MSC antes y después de la inducción. Como control positivo se emplearon células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC). La inducción in vitro de las MSC a estirpe endotelial fue capaz de aumentar la expresión de los marcadores endoteliales VEGF, CD31 y vWF, especialmente en las MSC de médula ósea y pulpa dental. El siguiente paso fue generar sustitutos de mucosa oral humana empleando el biomaterial de fibrina y agarosa, previamente optimizado, combinando fibroblastos de mucosa oral humana (HFOM) y cada tipo de MSC antes y después de la inducción vascular. Una vez generados los modelos mejorados de mucosa oral humana se implantaron en ratones atímicos durante una semana y se evaluó el potencial de vascularización de cada sustituto in vivo. La implantación in vivo dio lugar a un aumento significativo de la formación de vasos sanguíneos en la zona intermedia entre el sustituto artificial y los tejidos del huésped, con una expresión significativa de los marcadores vasculares VEGF, CD31, vWF y CD34 en comparación con los controles. Al igual que en el estudio in vitro, el valor fue más alto en las MSC diferenciadas de BMSC y DPSC. De este modo, los resultados obtenidos en la presente Tesis Doctoral suponen una importante mejora a nivel biomecánico y de vascularización de los modelos previamente desarrollados. Dichas mejoras, representan un avance para el potencial uso clínico de mucosa oral humana generada mediante protocolos de Ingeniería Tisular. La caracterización preclínica y el análisis de los controles de calidad desarrollados en la presente Tesis Doctoral constituyen un paso fundamental para su futura translación clínica.

Disorders of the human oral mucosa, such as oral cancer, trauma and periodontal diseases, are very prevalent conditions today. The treatment of these pathologies depends to a great extent on the availability of healthy human oral mucosa that allows replacement therapy, something that makes their treatment difficult due to the scarcity of donors. In this sense, Tissue Engineering emerges as a great alternative for the treatment of these pathologies, since it is a branch of medicine whose basic objective is the elaboration of artificial tissues that allow the repair, restoration or even the improvement of the functions of damaged tissues and organs. In the present Doctoral Thesis, first, the optimization of the biomechanical properties of the fibrin-agarose biomaterial, previously developed by the Tissue Engineering group of the University of Granada, has been carried out with the aim of generating improved models of human oral mucosa by means of tissue engineering protocols. Specifically, five different types of agaroses have been studied, each at four different concentrations, on which the biomechanical properties were evaluated. Improved models of human oral mucosa would allow the clinical treatment of conditions affecting the human oral mucosa. However, biointegration is a major problem in the generation of these artificial tissues, which could be favored by the generation of substitutes with a higher vascularization potential. In this sense, in this Doctoral Thesis a second optimization for the improvement of biointegration processes has been carried out based on the incorporation of human mesenchymal stem cells (MSC) with vascularization capacity in the stroma of human oral mucosa substitutes, to generate improved models of prevascularized human oral mucosa. Specifically, MSC obtained from adipose tissue (ADSC), bone marrow (BMSC) and dental pulp (DPSC) were used. The three types of MSC were differentiated to endothelial lineage using inducing media. Once vascular differentiation was induced, the vascularization potential of MSCs was assessed before and after induction. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were used as a positive control. In vitro induction of MSCs to endothelial lineage was able to increase the expression of endothelial markers VEGF, CD31 and vWF, especially in bone marrow and dental pulp MSCs. The next step was to generate human oral mucosal surrogates using the previously optimized fibrin-agarose biomaterial by combining human oral mucosal fibroblasts (HFOM) and each type of MSC before and after vascular induction. Once generated, the enhanced human oral mucosa models were implanted into athymic mice for one week and the vascularization potential of each surrogate was assessed in vivo. In vivo implantation resulted in a significant increase in blood vessel formation in the intermediate zone between the artificial surrogate and host tissues, with significant expression of the vascular markers VEGF, CD31, vWF and CD34 compared to controls. As in the in vitro study, the value was higher in MSCs differentiated from BMSCs and DPSCs. Thus, the results obtained in this doctoral thesis represent a significant improvement in biomechanical and vascularization of the previously developed models. These improvements represent an advance for the potential clinical use of human oral mucosa generated by tissue engineering protocols. The preclinical characterization and analysis of the quality controls developed in this Doctoral Thesis constitute a fundamental step for its future clinical translation