Emisión del gas invernadero óxido nitroso por la simbiosis Rhizobium etli-Phaseolus vulgaris

Abstract

El óxido nitroso (N2O) es un potente gas de efecto invernadero (GEI) y agente destructor de la capa de ozono (O3), debido, por un lado, a su gran potencial radiativo, que es unas 310 veces superior al del CO2 (revisado por Aryal et al., 2020), y, por otro, a su alta estabilidad en la atmósfera. Con una vida media estimada en la atmósfera de unos 116±9 años (Prather et al., 2015), este gas entra dentro de la clasificación de gases de efecto invernadero de larga vida (GEILV). Aunque la emisión de N2O a la atmósfera es relativamente baja en comparación con otros gases (0,03 %), debido a las características anteriormente mencionadas, se calcula que contribuye al calentamiento global en un 6%, siendo el tercer gas con mayor impacto después del dióxido de carbono (CO2) y el metano (CH4) (IPCC, 2019). El N2O se produce tanto en ambientes naturales (océanos, bosques y sabanas principalmente), como por fuentes antropogénicas (la agricultura, la quema de biomasa, las plantas de producción energética, las plantas de tratamiento de aguas residuales, los motores de combustión y la producción de ácido nítrico). Ambas fuentes suponen un 57% y un 43 % de la emisión anual de este gas a la atmósfera, respectivamente, según estudios recientes (IPCC, 2019; Tian et al., 2020; revisado en Aryal et al., 2022). En las últimas cuatro décadas, la emisión de N2O debida a fuentes antropogénicas ha sufrido un aumento sustancial, incrementándose de 5.6 Tg N/año en los años 80 a 7.3 Tg N/año en la década 2007-2016. Hasta el 87% de este aumento se debe a la emisión directa de la agricultura (71%) y a la emisión indirecta por las adiciones antrópicas de nitrógeno en los suelos (16%) (Tian et al., 2020). La mayoría de las fuentes naturales, y aquellas derivadas de la agricultura, emiten N2O debido al metabolismo microbiano de compuestos nitrogenados y el aumento en sus emisiones se atribuye principalmente al uso extensivo de fertilizantes nitrogenados tras el descubrimiento del proceso de Haber-Bosch (Shcherbak et al., 2014). Estos compuestos son metabolizados por los microorganismos del suelo, siendo la nitrificación y la desnitrificación microbiana los principales procesos implicados en la emisión de este gas. Mientras que la nitrificación ocurre en condiciones aeróbicas, la desnitrificación es un proceso que ocurre en ambientes con limitación de oxígeno. La desnitrificación consiste en la reducción secuencial de nitrato (NO3-) o nitrito (NO2-) a óxido nítrico (NO), N2O y finalmente, dinitrógeno (N2). En este proceso participan cuatro enzimas: las nitrato reductasas respiratorias (Nar o Nap), las nitrito reductasas (NirS o NirK), las óxido nítrico reductasas (cNor, qNor o CuANor) y la óxido nitroso reductasa (Nos). Esta ruta constituye una fuente sustancial de sus intermediarios gaseosos NO y N2O. Por ello, conocer los microorganismos, así como los factores ambientales y reguladores implicados en este proceso es vital para establecer y desarrollar estrategias de mitigación. En este sentido, el grupo de “Metabolismo del Nitrógeno en Bacterias Rizosféricas” (NitroRhiz) del Departamento de Microbiología del Suelo y la Planta de la Estación Experimental del Zaidín (CSIC), ha desarrollado varios proyectos de investigación en esta línea de investigación. Los rizobios son organismos diazotrofos del suelo con una capacidad muy especial y restringida a un pequeño grupo de microorganismos, que es la de fijar N2 atmosférico (inaccesible para la mayoría de organismos) hasta una forma biodisponible, el amonio (NH4+). Además, otra característica única de este grupo es su forma de vida dual, pudiendo vivir libremente o asociados a plantas leguminosas. Esta asociación simbiótica supone una gran ventaja para las leguminosas, pues les permite desarrollarse en ambientes con escasez de nitrógeno (N), un macronutriente esencial para las plantas y la vida en este planeta. Por este motivo, las leguminosas se han usado tradicionalmente en los sistemas de rotación de cultivos con objeto de aumentar la fertilidad de los suelos. Más aún, estas plantas son una importante fuente de proteína vegetal, así como de otros metabolitos nutricionalmente valiosos y suponen la base de la alimentación en algunos países. Por todas estas razones, la simbiosis rizobio-leguminosa posee un enorme potencial para el desarrollo de una agricultura sostenible. Sin embargo, recientemente en el grupo NitroRhiz se ha demostrado la capacidad de los nódulos de la soja (Glycine max) y la alfalfa (Medicago truncatula), dos de las leguminosas de mayor importancia agroeconómica, de producir NO y N2O a través de la desnitrificación en los bacteroides, las formas especializadas de los rizobios en los nódulos. En concreto, se ha demostrado la producción de NO (Sánchez et al., 2010) y N2O (Tortosa et al., 2015; 2020) en nódulos de soja inoculada con Bradyrhizobium diazoefficiens en respuesta a la presencia de NO3- y encharcamiento, así como la producción de N2O por la simbiosis M. truncatula-Ensifer meliloti, también en respuesta a NO3- y encharcamiento (Pacheco et al., 2023). Asimismo, se ha establecido en ambos sistemas simbióticos, la importancia del cobre como factor modulador del proceso de desnitrificación y, por tanto, de la producción de N2O (Tortosa et al., 2020; Pacheco et al., 2023). En esta Tesis se ha abordado el estudio de la emisión de N2O por la simbiosis Rhizobium etli- Phaseolus vulgaris. P. vulgaris (judía) es una leguminosa de gran importancia agroeconómica a nivel mundial que puede establecer simbiosis con varios rizobios. R. etli CE3, derivado de CFN42, es un desnitrificante “incompleto”, puesto que carece de nitrato reductasas respiratorias (Nar, Nap), que son las que llevan a cabo el primer paso de la desnitrificación (reducción de NO3- a NO2-), así como de óxido nitroso reductasa (Nos), la enzima que lleva a cabo el último paso de la desnitrificación (reducción de N2O a N2). Sin embargo, esta bacteria posee los genes nirK y nor, que codifican una nitrito reductasa (NirK) y una óxido nítrico reductasa (cNor), respectivamente (Bueno et al., 2005; Gómez-Hernández et al., 2011). En esta Tesis, se ha podido identificar y caracterizar una nitrato reductasa asimilativa (NarB) que reduce el NO3- a NO2- en el citosol de la bacteria, así como un transportador NO3-/NO2- (NarK) que permite la extrusión del NO2- desde el citoplasma al espacio periplásmico, donde, bajo condiciones de limitación de oxígeno (O2), será reducido a NO y N2O por las enzimas NirK y cNor, respectivamente. En condiciones de vida libre, las cepas mutantes narB (construida en este trabajo), nirK y norC (Gómez-Hernández et al, 2011) no emitieron N2O cuando se cultivaron con NO3- como única fuente de N a diferencia de la cepa WT. Mientras que la cepa narK (construida en este trabajo) produjo menos N2O que la WT. Además, se ha constatado que NarB es necesaria para la inducción por NO3- de la expresión de los genes nor, y que la molécula señal que induce la expresión de dichos genes es el NO. Todos estos resultados han permitido demostrar la capacidad de R. etli de producir N2O a partir de NO3- gracias al acoplamiento de dos rutas fundamentales del ciclo del N: la asimilación de NO3- y la desnitrificación. Asimismo, en esta Tesis se ha demostrado por primera vez, que los nódulos de plantas de judía inoculadas con R. etli y regadas con una solución rica en NO3-, emiten N2O, mientras que el encharcamiento se ha descartado como factor inductor de dicha emisión, debido a la alta sensibilidad de la simbiosis R. etli-judía a este estrés. También se ha confirmado que en la emisión de N2O por los nódulos de judía intervienen las proteínas NarB, NarK, NirK y cNor de R. etli, lo que se ha demostrado mediante el uso de cepas mutantes en los genes que codifican para dichas proteínas. La implicación de NarB en la emisión de N2O tanto en vida libre como en simbiosis también se ha demostrado utilizando una cepa que sobreexpresa narB. Más aún, se ha demostrado mediante el análisis por espectroscopía de resonancia paramagnética electrónica (EPR) de nódulos enteros, el papel de NarB y cNor en la modulación de los niveles de esencial molécula señalizadora NO en estos órganos simbióticos. El conocimiento generado en esta Tesis sobre la emisión de N2O por la simbiosis R. etli-judía, incrementa el generado por el grupo NitroRhiz en los últimos años y ha permitido la identificación de nuevos sistemas implicados en la emisión de N2O en leguminosas de gran interés agronómico en nuestro país, tales como la judía. Este conocimiento será muy valioso para el diseño de estrategias apropiadas de mitigación de la emisión de N2O por cultivos de leguminosas.

Nitrous oxide (N2O) is a potent greenhouse gas (GHG) and ozone depleting agent (O3) due to its high radiative potential, which is about 310 times higher than that of CO2 (reviewed by Aryal et al., 2020), and its high stability in the atmosphere. With an estimated half-life in the atmosphere of about 116±9 years (Prather et al., 2015), this gas falls into the classification of long-lived greenhouse gases. Although the emission of N2O to the atmosphere is relatively low compared to other gases (0.03 %), due to the above-mentioned characteristics, it is estimated to contribute 6% to global warming, being the third most impactful gas after carbon dioxide (CO2) and methane (CH4) (IPCC, 2019). N2O is produced both in natural environments (mainly oceans, forests and savannahs) and by anthropogenic sources (agriculture, biomass burning, power plants, wastewater treatment plants, combustion engines and nitric acid production). Over the last four decades, N2O emission due to anthropogenic sources has increased substantially, rising from 5.6 Tg N/year in the 1980s to 7.3 Tg N/year in the decade 2007-2016. Up to 87% of this increase is due to direct emission from agriculture (71%) and indirect emission from anthropogenic additions of nitrogen to soils (16%) (Tian et al., 2020). Most natural sources, and those derived from agriculture, emit N2O due to microbial metabolism of nitrogen compounds and the increase in emissions is mainly attributed to the extensive use of nitrogen fertilisers. These compounds are metabolised by soil microorganisms, with nitrification and microbial denitrification being the main processes involved in the emission of this gas. While nitrification occurs under aerobic conditions, denitrification is a process that occurs in oxygenlimited environments. Denitrification consists of the sequential reduction of nitrate (NO3-) or nitrite (NO2-) to nitric oxide (NO), N2O and finally dinitrogen (N2). Four enzymes are involved in this process: respiratory nitrate reductases (Nar or Nap), nitrite reductases (NirS or NirK), nitric oxide reductases (cNor, qNor or CuANor) and nitrous oxide reductase (Nos). This process is a substantial source of their gaseous intermediates NO and N2O. Therefore, knowledge of the microorganisms, as well as the environmental and regulatory factors involved in this process is vital to establish and develop mitigation strategies. In this sense, the "Nitrogen Metabolism in Rhizospheric Bacteria" (NitroRhiz) group of the Department of Soil and Plant Microbiology of the “Estación Experimental of Zaidín” (CSIC) has developed several projects in this line of research. Rhizobia are soil diazotrophic organisms with a very special ability, restricted to a small group of microorganisms, that is to fix atmospheric N2 (inaccessible to most organisms) to a bioavailable form, ammonium (NH4+). In addition, another unique feature of this group is their dual life form, being able to live freely or in association with leguminous plants. This symbiotic association is a great advantage for legumes, as it allows them to thrive in environments with a shortage of nitrogen (N), an essential macronutrient for plants and life on this planet. For this reason, legumes have traditionally been used in crop rotation systems to increase soil fertility. Moreover, these plants are an important source of vegetable protein as well as other nutritionally valuable metabolites and are the basis of diets in some countries. For all these reasons, the rhizobia-legume symbiosis has enormous potential for the development of sustainable agriculture. Recently, however, the NitroRhiz group has demonstrated the ability of soybean (Glycine max) and alfalfa (Medicago truncatula) nodules, two of the most agro-economically important legumes, to produce NO and N2O through denitrification in bacteroids, the specialised forms of rhizobia in the nodules. Specifically, NO (Sánchez et al., 2010) and N2O (Tortosa et al., 2015; 2020) production has been demonstrated in soybean nodules inoculated with Bradyrhizobium diazoefficiens in response to NO3- and flooding. Similarly, N2O production by the Ensifer meliloti-M. truncatula symbiosis, has also been found to be induced in response to NO3- and flooding (Pacheco et al., 2023). Likewise, the importance of copper as a modulating factor of the denitrification process and, therefore, of N2O production has been established in both symbiotic systems (Tortosa et al., 2020; Pacheco et al., 2023). In this Thesis, the study of N2O emission by the Rhizobium etli-Phaseolus vulgaris symbiosis has been addressed. P. vulgaris (common bean) is a legume of great agro-economic importance worldwide. R. etli CE3, derived from R. etli CFN42, is an "incomplete" denitrifier, as it lacks respiratory nitrate reductases (Nar, Nap), which carry out the first step of denitrification (reduction of NO3- to NO2-), as well as nitrous oxide reductase (Nos), the enzyme that carries out the last step of denitrification (reduction of N2O to N2). However, this bacterium possesses the nirK and nor genes, which encode a nitrite reductase (NirK) and a nitric oxide reductase (cNor), respectively (Bueno et al., 2005; Gómez-Hernández et al., 2011). In this Thesis, it has been possible to identify and characterise an assimilatory nitrate reductase (NarB) that reduces NO3- to NO2- in the bacterial cytosol, as well as a NO3-/NO2- transporter (NarK) that allows the extrusion of NO2- from the cytoplasm to the periplasmic space, where, under oxygen (O2)-limited conditions, it will be reduced to NO and N2O by the NirK and cNor enzymes, respectively. Under free-living conditions, the narB (built in this work), nirK and norC (Gómez-Hernández et al, 2011) mutant strains did not emit N2O when grown with NO3- as the sole source of N unlike the WT strain. While strain narK (built in this work), produced less N2O than WT. In addition, it was found that NarB is necessary for NO3- dependent induction of nor genes expression, and that the signal molecule that induces the expression of these genes could be NO. All these results have demonstrated the ability of R. etli to produce N2O from NO3- thanks to the coupling of two fundamental pathways of the N cycle: NO3- assimilation and denitrification. Moreover, in this Thesis it has been demonstrated for the first time that the nodules of common bean plants inoculated with R. etli and irrigated with a solution containing NO3-, emit N2O, while flooding has been ruled out as a factor inducing this emission, due to the high sensitivity of the R. etli-common bean symbiosis to this stress. The involvement of R. etli NarB, NarK, NirK and cNor proteins in N2O release from bean nodules has also been confirmed and demonstrated by using mutant strains in the genes coding for these proteins. The involvement of NarB in N2O emission, both under free living conditions and in symbiosis, has also been demonstrated using a strain overexpressing NarB. Furthermore, the role of NarB and cNor in the modulation of NO levels, a central signalling molecule in plants, has been demonstrated by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy analysis of whole nodules. The knowledge generated in this Thesis on N2O emission by the R. etlicommon bean symbiosis increases the knowledge generated by the NitroRhiz group in recent years and has allowed the identification of new systems involved in N2O emission in legumes of great agronomic interest in our country, such as common beans. This knowledge will be very valuable for the design of appropriate N2O emission mitigation strategies for leguminous crops.