Identificación de macromoléculas como potenciales biomarcadores útiles para el control de la enfermedad de Chagas

Abstract

La infección por el parásito Trypanosoma cruzi causa la enfermedad de Chagas, considerada una de las enfermedades tropicales desatendidas más prevalentes, afectando aproximadamente a 6-7 millones de personas en el mundo, estando presente en zonas no endémicas debido a los flujos migratorios. La enfermedad, tras la fase aguda, evoluciona hacia una fase crónica asintomática, clínicamente silente, llamada fase indeterminada que puede durar décadas y en la que existe un frágil equilibrio entre la replicación del parásito y la respuesta inmunitaria del huésped. Así, el 30-40% de los pacientes crónicos desarrollan una fase sintomática que se caracteriza, principalmente, por alteraciones cardíacas y digestivas. El tratamiento se basa en la eliminación del parásito en sangre, siendo los fármacos de elección el benznidazol y nifurtimox. Existe controversia sobre su eficacia en la fase crónica y si su efectividad disminuye en la fase sintomática. Para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas, se aplican técnicas serológicas convencionales. Sin embargo, éstas no son útiles para evaluar el status clínico del paciente ni el impacto del tratamiento. El diagnóstico por PCR se ve dificultado por la escasa presencia de parásitos en sangre y fluctuaciones en la parasitemia por lo que se genera un alto porcentaje de falsos negativos. La infección por T. cruzi desencadena múltiples mecanismos inmunitarios de respuesta innata y adaptativa en el huésped para combatir el patógeno. Dado que el parásito es intracelular y se replica dentro de las células, la respuesta celular de la inmunidad adaptativa del huésped desempeña un papel fundamental. Esta función está orquestada principalmente por los linfocitos T, que reconocen los antígenos del parásito y promueven funciones específicas para controlar la infección. La alta variabilidad existente entre las cepas del parasito T. cruzi, que afecta a su biología y, consecuentemente, a su virulencia, tropismo, etc., dificulta aún más su control. Los genomas de tripanosomátidos están colonizados por retrotransposones sin LTR que presentan una secuencia de 77 nt altamente conservada en sus extremos 5′, conocida como huella Pr77. La amplia distribución de la huella Pr77 podría estar relacionada con los procesos de regulación génica en estos organismos, ya que esta presenta actividad promotora y ribozima, similar a las del virus de la hepatitis delta (HDV), a nivel de ADN y ARN, respectivamente. Sobre estas bases, en la presente Tesis se marcó como un primer objetivo la identificación de los retrotransposones portadores de la huella Pr77 y de material genético de interés contenido en los genomas de seis cepas de T. cruzi que pertenecen a distintos DTU y provienen de diferentes orígenes geográficos y hospedadores/vectores. Los resultados mostraron diferencias entre los seis genomas en el número de copias de genes implicados en procesos de virulencia, en la abundancia de retrotransposones que portan la huella Pr77, así como la presencia de huellas Pr77 no asociados a retroelementos (Pr77Sh). También, se observaron asociaciones frecuentes de retrotransposones portadores de Pr77 y de Pr77Sh con genes que codifican para proteínas relevantes desde el punto de vista de la biología del parásito, tales como trans-sialidasas, RHS, MASP, mucinas, etc., mostrando una proporción variable según el tipo de retroelemento, la clase de gen y la cepa del parásito. Dada la función dual promotor/ribozima descrita para Pr77 de L1Tc, otro de los objetivos de esta Tesis fue la caracterización de las mencionadas huellas Pr77 no asociadas a retroelementos. Los resultados obtenidos mostraron que en la mayoría de las cepas a estudio existían huellas Pr77Sh que mantienen conservado el motivo DPE (Downstrem Promoter Element) en términos de composición de la secuencia y localización respecto al sitio de inicio de la transcripción. Interesantemente, ensayos in vitro de corte co-transcripcional y post-transcripcional mostraron la existencia de actividad ribozima en algunas de las huellas Pr77Sh estudiadas. En cuanto a su sitio de inserción, se observó que se encontraban localizadas en diferentes puntos del genoma y frecuentemente asociadas a genes relevantes para la biología del parásito. Todo ello sugiere un importante papel funcional de estas secuencias en la regulación de la expresión génica de este parásito. Por otro lado, el genoma de la cepa SOL de T. cruzi, fue secuenciado por tecnología PacBio, formando parte de esta Tesis la determinación del contenido de retroelementos portadores de Pr77 y genes de interés identificados en dicha cepa, así como la expresión diferencial existente entre las formas epimastigotas, amastigotas y tripomastigotas del parásito. Por otra parte, y sobre la base de los antecedentes expuestos, la identificación de marcadores de progresión de la enfermedad, así como de eficacia terapéutica resulta esencial para el adecuado diagnóstico y seguimiento de los pacientes de Chagas en su fase crónica. En este contexto, se propuso como un segundo objetivo de la presente Tesis evaluar varias moléculas como biomarcadores serológicos de diagnóstico de la enfermedad y eficacia del tratamiento farmacológico. Los resultados obtenidos mostraron una alta sensibilidad y especificidad para las moléculas recombinantes KMP11, PFR2 y para el péptido sintético 3973d. Asimismo, se determinó que el set formado por los antígenos de T. cruzi KMP11, HSP70, PFR2 y 3973d era una herramienta útil como marcador temprano de eficacia del tratamiento con benznidazol en los pacientes crónicos de Chagas. Además, se planteó como un tercer objetivo de la presente Tesis el estudio de los patrones de expresión de genes implicados en la respuesta del sistema inmunitario humano a la infección por T. cruzi, mediante tecnología OpenArray®, en pacientes crónicos con enfermedad de Chagas en sus distintas fases clínicas y tras el tratamiento con benznidazol. Los resultados obtenidos revelaron la existencia de un perfil de expresión diferencial, específica de antígeno, entre los pacientes en fase indeterminada y sujetos sanos, identificándose tanto la activación como la depleción significativa de numerosos genes en dichos pacientes versus sujetos sanos, así como la activación de varias relevantes rutas de respuesta inmunitaria. Del mismo modo, se observaron patrones diferenciales de expresión entre los pacientes crónicos en fase indeterminada y aquellos en fase cardiaca en genes implicados en la respuesta inmune celular antígeno-específica. Interesantemente, también hemos puesto de manifiesto que el tratamiento con benznidazol modula el patrón de expresión de dichos genes, tanto en pacientes asintomáticos como con sintomatología cardiaca. Estos perfiles de expresión génica diferencial detectados en los pacientes crónicos de Chagas, así como las rutas inmunológicas que parecen estar activadas o inhibidas, podrían dar lugar a la identificación de potenciales biomarcadores de progresión de la enfermedad y/o de eficacia del tratamiento, así como actuar como posibles dianas terapéuticas útiles para el control inmuno-terapéutico de la enfermedad crónica de Chagas.