Papel del glutatión en la biología reproductiva del olivo

Abstract

Reactive oxygen species (ROS) play important roles in plant physiology. Historically, they have been known because of their accumulation as a consequence of different stresses, even triggering cell damage. However, they are also presently known because of their beneficial and necessary functions (i.e. signaling), which are beginning to be described in plant reproductive processes. Cells display a complex network of antioxidants, composed by both enzymes and non-enzymatic molecules preventing excessive accumulation of ROS which may cause damage to biomolecules. Glutathione is a low molecular multifunction metabolite playing a critical antioxidant function, contributing to redox signaling, modulation of gene expression and the regulation of different enzyme activities. However, little is known regarding its regulative role in the plant reproductive processes. Glutathione is synthetized through the sequential action of γ-glutamyl-cysteine synthetase (γ-ECS) and glutathione synthetase (GS). A broad metabolic network is responsible of maintaining redox homeostasis as well as of keeping a high level of glutathione at the reduced state (GSH), which is the main form within the cell. The glutathione reductase enzyme (GR) is responsible of reducing oxidized glutathione (GSSG) to GSH, which will be used by glutathione peroxidase (GPX) and glutathione S-transferase (GST) enzymes to detoxify ROS and conjugate to xenobiotics, respectively. The main objective of the present thesis is focused into the analysis of the physiological role of glutathione and the enzymes involved in its metabolism into the different stages of the reproductive process of the olive tree, one of the most important crops in Spain. With this aim, new genomic and proteomic approaches have been used and the expression of the most relevant gene products has analyzed, as well as their activity, molecular characteristics and cell localization by using a broad panel of molecular, biochemical and cell methods available. Analyses have been performed using olive anthers at different developmental stages, as well as mature olive pollen (dehiscent) and olive pollen induced to germinate in vitro, at different times after germination onset. Moreover, functional studies have been performed in Arabidopsis as a comparison. Final purpose of these studies is the generation of functional models determining basic relationships between the different agents involved in the metabolism and signaling mediated by glutathione during microsporogenesis and pollen tube emergence, growth and orientation. First, a bioinformatic approach was performed to identify genes of interest (γ-ECS, GS, GR, GPX and GST) from different databases, including the reproductive transcriptome of the olive tree (reprOlive), and after using an experimental validation carried out by PCR using oligonucleotides designed on the basis of partial sequences and 3'/5'-RACE. Bioinformatic analysis consisted in the generation of alignments with the retrieved sequences among themselves and also using heterologous sequences of interest, the generation of phylogenetic trees, the prediction of secondary and 3-D structures of the encoded proteins, their cell localization and their potential posttranslational modifications including phosphorylation, potential S-nitrosylation, acetylation, miristoylation or palmitoylation, as well as potential excisions. For this purpose, a broad panel of bioinformatic tools on-line was used. These analyses allowed identifying the presence of both conserved and specific sequences in the olive pollen, compared with somatic tissues or several descriptions present in the literature. In a second place, expression profiles of the genes of interest γ-ECS, GS, GR, GPX and GST were determined by means of Q-PCR experiments after designing specific primers. Determination of the transcripts levels was performed using cDNA generated from anthers at different stages of pollen development (pollen mother cells, tetrads, microspores), mature olive pollen and pollen at different times along in vitro pollen germination. Through these stages, the presence of the mentioned enzymes was also determined and quantified by Western blotting, using heterologous antibodies raised to conserved forms of the enzymes in Arabidopsis. In addition to the mentioned enzymes, we also determined the presence and levels of GSH and GSSG, now by using LC-MS. Biochemical information retrieved was also complemented by performing immunocytochemical analyses to determine cell localization of both the enzymes and GSH, which is present in microsporocytes and other anther tissues (including the tapetum) all through its development, as well as at the olive pollen grain and the pollen tube, with a broad distribution comprising the cytosol, pollen apertures and nuclei with a noticeable intensity. Nuclear localization of GSH suggests the involvement of this molecule in the control of the cell cycle. Finally, a comparative assessment of GSH metabolism was performed in three Arabidopsis thaliana genotypes: a wild genotype (WT), a mutant expressing a Green fluorescent protein sensitive to the redox state (roGFP2), and a double-mutant deficient in glutathione cad2-1, also simultaneously expressing the redox reporter (cad-1/roGFP2), whose flowers harbored less GSH and more GSSG than WT or roGFP flowers. Stigmas, styles, anthers, germinated pollen grains and pollen tubes of roGFP2 flowers showed a lower level of oxidation, which was higher at the cad-1/roGFP2 instead. The ungerminated pollen grains were significantly more oxidized than the germinated pollen grains, indicating that the pollen cells become reduced upon the transition from the quiescent to the metabolically active state during germination. The germination percentage was lower in cad2-1/roGFP2 pollen and pollen tube growth arrested earlier than in roGFP2 pollen, demonstrating that increased cellular reduction is essential for pollen tube growth. These findings establish that ungerminated pollen grains exist in a relatively oxidized state compared with germinating pollen grains. Moreover, failure to accumulate glutathione and maintain a high GSH/GSSG ratio has a strong negative effect on pollen germination.

Las especies de oxígeno reactivo (ROS) desempeñan importantes misiones en la fisiología vegetal. Históricamente, han sido conocidas por acumularse como consecuencia de diversos estreses, llegando a generar daño celular. Sin embargo, en la actualidad se conocen además numerosas funciones beneficiosas y necesarias (i.e señalización) que están empezando a ser descritas en los procesos reproductivos. Las células poseen una compleja red antioxidante compuesta tanto por enzimas como por moléculas no enzimáticas, que evitan que las ROS se acumulen en exceso, ocasionando daño a diversas biomoléculas. El glutatión es un metabolito multifuncional de bajo peso molecular, que juega un papel crucial como antioxidante, contribuyendo a la señalización redox, la modulación de la expresión génica y la regulación de diversas actividades enzimáticas. Sin embargo, se conoce poco sobre su papel regulador en los procesos reproductivos de las plantas. El glutatión se sintetiza mediante la acción secuencial de la γ -glutamilcisteína sintetasa (γ -ECS), y la glutatión sintetasa (GS). Existe una amplia red metabólica responsable del mantenimiento de la homeostasis redox y del nivel de glutatión en su estado reducido (GSH), que es la forma principal presente dentro de la célula. La enzima glutatión reductasa (GR) es responsable de la reducción del glutatión oxidado (GSSG) a GSH, que será utilizada por las enzimas glutatión peroxidasa (GPX) y glutatión S-transferasa (GST) para la detoxificación de ROS y la conjugación con xenobióticos, respectivamente. El objetivo general de la presente tesis se centra en el análisis del papel fisiológico del glutatión y de las enzimas de su metabolismo en las diferentes etapas del proceso reproductivo del olivo, uno de los cultivos más importantes en España. Con este propósito, se han utilizado nuevas herramientas genómicas y proteómicas disponibles y se ha analizado la expresión de los productos génicos más relevantes, su actividad, características moleculares y localización celular mediante un amplio panel de métodos moleculares, bioquímicos y celulares disponibles. Los análisis se han llevado a cabo en las anteras de olivo en distintos estadios de desarrollo, así como en polen maduro (dehiscente) y polen al que se ha inducido su germinación in vitro, a distintos tiempos desde su inicio. Además, como comparación se han realizado estudios funcionales en Arabidopsis. La finalidad última de la propuesta es la generación de modelos funcionales que determinen las relaciones básicas entre los diferentes agentes implicados en el metabolismo y la señalización mediada por glutatión durante la microsporogénesis, la emergencia, el crecimiento y la orientación del tubo polínico. En primer lugar, se realizó una aproximación bioinformática para identificar los genes de interés (γ -ECS, GS, GR, GPX y GST) a partir de diferentes bases de datos, incluido el transcriptoma reproductivo del olivo (reprOlive), y de una validación experimental realizada mediante PCR con oligonucleótidos diseñados a partir de secuencias parciales y 3'/5'-RACE. El análisis bioinformático consistió en la elaboración de alineamientos de las secuencias obtenidas entre sí y con heterólogos de interés, la generación de árboles filogenéticos, y la predicción de las estructuras secundarias y 3- D de las proteínas codificadas, de su localización celular y de sus posibles modificaciones postraduccionales incluyendo la fosforilación, S-nitrosilación potencial, acetilación, miristotilación o palmitoilación, así como posibles escisiones. Para ello se utilizó un amplio panel de herramientas bioinformáticas on-line. Estos análisis permitieron identificar tanto la presencia de isoformas conservadas como específicas en el polen del olivo respecto a tejidos somáticos o de algunas descripciones presentes en la literatura. En segundo lugar, se determinaron los perfiles de expresión de los genes de interés γ -ECS, GS, GR, GPX y GST mediante experimentos de Q-PCR tras diseñar cebadores específicos. La determinación de los niveles de transcritos se realizó a partir de cDNA de anteras en diversos estadios de desarrollo del polen (células madres del polen durante la meiosis, tétradas, microsporas), en polen maduro, y en polen a distintos tiempos a lo largo de la germinación in vitro. A lo largo de estos estadios se determinó y cuantificó igualmente la presencia de los enzimas mediante Western blotting, utilizando para ello anticuerpos heterólogos desarrollados frente a formas conservadas de los enzimas de Arabidopsis. Además de los enzimas indicados, se determinó la presencia y los niveles de GSH y GSSG, en este caso mediante el uso de LC-MS. La información bioquímica obtenida fue complementada con la realización de estudios inmunocitoquímicos para determinar la localización celular tanto de los enzimas como del GSH, que está presente en los microsporocitos y otros tejidos de la antera (incluyendo el tapetum) a lo largo de todo el desarrollo, así como en el grano de polen y el tubo polínico, con una amplia distribución que incluye el citosol, las aperturas del polen y los núcleos con una notable intensidad. La localización nuclear del GSH parece sugerir la participación del GSH en el control del ciclo celular. Por último, se realizó un estudio comparativo del metabolismo del GSH en tres genotipos de Arabidopsis thaliana: un genotipo silvestre (WT), un mutante que expresa una proteína verde fluorescente sensible al estado redox (roGFP2), y un doble mutante deficiente en glutatión cad2-1 expresando simultáneamente el marcador redox (cad- 1/roGFP2), cuyas flores tenían significativamente menos GSH y más GSSG que las flores WT o roGFP. El estima, estilo, antera, los granos de polen germinados y los tubos polínicos de las flores roGFP2 mostraron bajo nivel de oxidación, que sin embargo sí fue más alto en los mutantes cad-1/roGFP2. Los granos de polen sin germinar aparecieron más oxidados que los germinados, lo que indica que las células del polen incrementan su estado de reducción a lo largo de su activación metabólica. El porcentaje de germinación fue menor y el crecimiento del tubo polínico se detuvo antes en los mutantes cad-1/roGFP2 que en las plantas roGFP2, lo que demuestra que el crecimiento del tubo polínico precisa un estado esencialmente reducido. Los resultados obtenidos muestran que los granos de polen sin germinar presentan un estado relativamente oxidado comparado con los granos de polen germinados. Además, se demuestra que la no acumulación de GSH y el mantenimiento de una tasa GSH/GSSG alta tienen efectos negativos sobre la germinación del polen.