Generación de una plataforma para la producción de células CAR-T alogénicas: estudios de eficacia y seguridad
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Maldonado Pérez, NoeliaEditorial
Universidad de Granada
Director
Martín Molina, FranciscoDepartamento
Universidad de Granada. Programa de Doctorado en BiomedicinaFecha
2023Fecha lectura
2023-03-17Referencia bibliográfica
Maldonado Pérez, Noelia. Generación de una plataforma para la producción de células CAR-T alogénicas: estudios de eficacia y seguridad. Granada: Universidad de Granada, 2023. [https://hdl.handle.net/10481/81235]
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Tesis Univ. Granada.; Laboratorio de Terapia Génica y Celular del Departamento de Medicina Genómica, en el centro de Investigación Centro Pfizer – Universidad de Granada – Junta de Andalucía de Genómica e Investigación Oncológica (GENYO).; Fondo de Investigaciones Sanitarias, Instituto de Salud Carlos III Europeo de Desarrollo Regional (FEDER); Proyecto RD21/0017/0004 de la Red TerAv y los proyectos 2016000073391-TRA, 2016000073332-TRA, PI-57069, PAIDI-Bio326, CARTPI-0001-201, PECART-0031-2020 del CECEyU; Consejería de Salud y Familias de la Junta de Andalucía FEDER/Fondo de Cohesión Europeo por Andalucía; Contrato de Formación de Profesorado Universitario FPU17/02268 del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades; Becas EMBO-STF (8925) y EFIS-IL-STF (20200926)Resumen
Las células T autólogas modificadas con receptores de antígeno
quiméricos (CARs) han sido aprobadas como medicamentos de terapia
avanzada (ATMPs) contra varias neoplasias malignas de tipo B. Sin
embargo, su naturaleza autóloga impide su aplicación a todos los
pacientes que la necesiten, así como la estandarización de esta terapia.
Las células CAR-T alogénicas son una alternativa para simplificar este
proceso complejo y lento. En esta Tesis Doctoral se ha estudiado la
viabilidad (eficacia y seguridad) de la eliminación del TCR (TCRKO) para
generar células CAR-T alogénicas universales. Además, hemos
investigado la intervención metabólica con moléculas pequeñas como
una estrategia para mejorar los productos de células CAR-T, incluidas las
células TCRKO CAR-T. En concreto, el trabajo realizado se ha dividido en
dos bloques principales:
Determinación de la eficacia y seguridad de la edición genómica
para generar células CAR-T universales. Para ello se contó con la
colaboración del Dr Manel Juan y su donación del CAR ARI-0001, un CAR
αCD19 de segunda generación aprobado por la Agencia Española de
Medicamentos y Productos Sanitarios (AEMPS) en el marco de la
Exención Hospitalaria para el tratamiento de pacientes mayores de 25
años con leucemia linfoblástica aguda de células B
Recidivante/Refractaria (R/R LLA-B).
En primer lugar, se analizó la eficacia y los potenciales problemas de
seguridad que surgen tras la interrupción del locus TRAC utilizando la
tecnología CRISPR/Cas9. Demostramos que el uso de CRISPR/Cas9
entregado como ribonucleopartículas (RNPs) permite una depleción en
la expresión del TCR altamente eficiente (más del 80%) sin alteraciones
significativas en el fenotipo de las células T. Sin embargo, también
encontramos que la edición del locus TRAC puede conducir a grandes
deleciones en el genoma, lo que indica un potencial riesgo de este
procedimiento. Tal y como se esperaba, la eliminación del TCR en las
células ARI-CAR-T impidió eficientemente las respuestas alogénicas.
Además, el procedimiento utilizado no alteró de manera significativa su
fenotipo, manteniendo una actividad antitumoral similar ex-vivo e in vivo
en comparación con células ARI-CAR-T sin editar (WT ARI-CAR-T cells).
Estos resultados demuestran que, aunque todavía existen algunos
riesgos de genotoxicidad, la interrupción del TRAC es una estrategia
factible para la generación de células ARI-CAR-T universales y
funcionales. En este sentido, nuestro siguiente paso será validar el
proceso en condiciones de escalado y buenas prácticas de fabricación
(GMP) para proponer un ensayo clínico y/o exención hospitalaria para el
tratamiento de pacientes con linfomas o leucemias tipo B que hayan
agotado otras opciones y que no puedan acceder al tratamiento con
CAR-T comerciales.
Intervención metabólica con pequeñas moléculas para favorecer
productos CAR-T enriquecidos en células T memoria. Por otro lado,
en esta tesis también intentamos abordar uno de los problemas con los
que se encuentran las terapias CAR-T actuales: su agotamiento/falta de
persistencia antes de eliminar todas las células tumorales en los
pacientes, especialmente importante en la terapia con células CAR-T
alogénicas. En esta dirección, existe fuerte evidencia de que una mayor
presencia de células T memoria, con alta capacidad de autorrenovación
y pluripotencialidad (células T madre memoria, TSCM), se correlaciona
directamente con una mejor respuesta terapéutica.
En base a estos trabajos, entramos en colaboración con el Prof. Pedro
Romero, desarrollador de diversos procedimientos para reprogramar el
fenotipo de las células T mediante intervención metabólica. En esta
dirección estudiamos si la intervención metabólica durante la expansión
ex vivo podría ser un método para mejorar la actividad antitumoral de
las células TCRKO CAR-T alogénicas. En concreto, evaluamos dos
inhibidores, uno para la enzima mitocondrial isocitrato deshidrogenasa
2 (IDH2) y otro para el transportador mitocondrial de piruvato (MPC).
Estos estudios relevaron un incremento en el fenotipo TSCM en células
WT y TCRKO ARI-CAR-T tratadas con el inhibidor para MPC (MPCi),
aunque no con el inhibidor para IDH2 (IDH2i). La inhibición de MPC no
comprometió la expansión de las células CAR-T ni la producción de citoquinas. Las células ARI-CAR-T pre-tratadas con el MPCi mostraron
una función efectora antitumoral superior, pero variable en función del
modelo utilizado. Esta variabilidad en el incremento de la eficacia precisa
ser investigada en modelos animales y, en función de los resultados,
propondremos su futura aplicación en protocolos de generación de
células CAR-T alogénicas. Autologous T cells expressing chimeric antigen receptors (CARs) have
been approved as advanced therapy medicinal products (ATMPs)
against several type B malignancies. However, a main drawback comes
from their autologous nature which limits the amount of patients that
can be treated and precludes its standardization. Allogeneic CAR-T cells
are an alternative to simplify this complex and time-consuming process.
In this Doctoral Thesis, we have studied the feasibility (efficacy and
safety) of TCR knockdown (TCRKO) to generate universal allogeneic
CAR-T cells. In addition, we have investigated metabolic intervention
with small molecules as a way to improve CAR-T cell products, including
TCRKO CAR-T cells. Specifically, the work carried out has been divided
into two main objectives:
Determination of genome editing efficacy and safety to generate
Universal CAR-T cells. For this, we had the collaboration of Dr Manel
Juan who donated the CAR ARI-0001, a second generation αCD19 CAR
approved by the Spanish Agency for Medicines and Medical Devices
(AEMPS) within the framework of Hospital Exemption for the treatment
of patients older than 25 years with Relapsed/Refractory acute B cell
lymphoblastic leukemia (R/R B-ALL).
First, the efficacy and potential safety concerns that arise after disruption
of the TRAC locus using the CRISPR/Cas9 system were analyzed. We
show that the use of CRISPR/Cas9 delivered as ribonucleoparticles
(RNPs) allows highly efficient TCR depletion (over 80%) without
significant alterations in T cell phenotype. However, we have also found
that efficient TCRKO can lead to on-target large deletions in the
genome, indicating a potential risk of this procedure. As expected, TCR
elimination of ARI-CAR-T cells efficiently prevented allogeneic
responses. Importantly, the procedure did not significantly alter ARICAR-
T cell phenotype, while maintaining a similar antitumor activity ex
vivo and in vivo compared to unedited ARI-CAR-T cells (WT ARI-CAR-T
cells). These results demonstrate that, although some risks of genotoxicity still exist, TRAC disruption is a feasible strategy for the
generation of functional universal ARI-CAR-T cells. In this sense, our next
step will be to validate the process under escalation and good
manufacturing practices (GMP) to propose a clinical trial and/or hospital
exemption for the treatment of patients with type B lymphomas or
leukemias who have no other options and who can not access
commercial CAR-T therapy.
Metabolic intervention with small molecules to favour CAR-T
products enriched in memory T cells. On the other hand, in this thesis
we have also tried to address one of the problems that current CAR-T
therapies encounter: their exhaustion/lack of persistence before
eliminating all the tumor cells in patients, especially important in
allogeneic CAR-T cell therapies. In this direction, there is strong evidence
that a greater presence of memory T cells, with a high capacity for selfrenewal
and pluripotency (T stem cell memory, TSCM), is directly
correlated with a better therapeutic response.
Based on these studies, we entered in collaboration with Prof. Pedro
Romero, who had developed various procedures to reprogram T cell
phenotype through metabolic intervention. In this direction, we studied
whether metabolic intervention during ex vivo expansion could be a
method to improve the antitumor activity of allogeneic TCRKO CAR-T
cells. Specifically, we evaluated two inhibitors, one for the mitochondrial
enzyme isocitrate dehydrogenase 2 (IDH2) and another for the
mitochondrial pyruvate transporter (MPC). These studies revealed an
increase in TSCM phenotype in WT and TCRKO ARI-CAR-T cells treated
with the inhibitor for MPC (MPCi), although not with the inhibitor for
IDH2 (IDHi). MPC inhibition did not compromise CAR-T cell expansion
or cytokine production. ARI-CAR-T cells pre-treated with MPCi showed
a higher antitumor effector function which varies depending on the
model used. This variability in increasing efficacy needs to be
investigated in animal models and, based on the results, we will propose
its future application in protocols for the generation of allogeneic CART
cells.