Búsqueda de nuevos factores de virulencia en la cepa Bacillus pumilus 15.1, una cepa entomopatógena activa frente a la mosca de la fruta del Mediterráneo

Abstract

En este trabajo se ha realizado una búsqueda de posibles factores de virulencia que la cepa entomopatógena Bacillus pumilus 15.1 puede presentar en su genoma que expliquen su actividad frente la Mosca de la fruta del Mediterráneo Ceratitis capitata. Esta cepa, aislada en el año 2010 por nuestro grupo de investigación, presenta un importante valor biotecnológico, y ha sido objeto de estudio desde entonces, por ser activa frente a una de las principales plagas en agricultura a nivel mundial. Se han clonado varios genes, potenciales factores de virulencia encontrados en el genoma de B. pumilus 15.1, con objeto de realizar su expresión heteróloga y permitir la obtención de una alta cantidad de proteína para evaluar su actividad en ensayos de contaminación de dieta con larvas de C. capitata. Así, por ejemplo, se ha clonado el gen de la enzima oxalato descarboxilasa, principal componente de los cristales paraesporales producidos por la cepa B. pumilus 15.1 durante la etapa de esporulación. La proteína OxdD recombinante sobreexpresada mostró actividad enzimática, al igual que la enzima nativa, y fue capaz de catalizar la descarboxilación del oxalato hasta formiato. Aunque la enzima no fue tóxica para larvas de C. capitata, se demostró que el formiato, producto de la enzima, si provocó un retraso en el desarrollo de las larvas. El análisis del genoma de B. pumilus 15.1 permitió también identificar dos ORFs putativos cuyos productos fueron similares a proteínas con actividad entomopatógena, XnGroEL, de Xhenorhabdus nematophila y la proteína Enolasa de Paenibacillus larvae. Los genes responsables de la codificación de estas proteínas fueron clonados en vectores de expresión para llevar a cabo la expresión heteróloga de estas proteínas, las cuales fueron bioensayadas para observar su efecto sobre larvas de primer estadio de C. capitata. Además, se llevó a cabo la caracterización de una región del genoma de B. pumilus 15.1 con alto contenido de genes homólogos a genes de bacteriófagos. Como consecuencia de esta caracterización se ha podido determinar que B. pumilus 15.1 posee en su genoma un fago, Bp15.1Hope, no descrito anteriormente, y una partícula similar a un fago, Bp15.1PLP, que presenta actividad bacteriocina. Ambas partículas se producen en condiciones de estrés para la célula y su morfología y características pueden ser observadas mediante MET. Estas partículas se encontraron codificadas por regiones colindantes en el genoma de B. pumilus 15.1, pero son independientes entre sí, y parecen tener un origen distinto. La abundancia de estas partículas en lisados de cultivos de B. pumilus 15.1 inducidos con Mitomicina C fue muy diferente. Mientras que la partícula Bp15.1PLP fue muy abundante en los sobrenadantes de los cultivos lisados, el fago Bp15.1Hope, fue muy escaso. El material genético presente en las partículas Bp15.1PLP, similar al profago PBSX de B. subtilis, fue de un tamaño de 9 Kb, y no correspondió al ADN responsable para la codificación de la partícula, sino que fue ADN bacteriano. Las partículas Bp15.1PLP presentaron además una fuerte actividad bactericida hacia bacterias relacionadas filogenéticamente con B. pumilus. Se demostró también que la actividad bactericida fue muy específica y dependiente de la unión de la partícula a la superficie de las bacterias susceptibles. El efecto de las partículas Bp15.1PLP codificadas por la cepa entomopatógena B. pumilus 15.1 sobre las larvas de C. capitata fue también analizado en bioensayos de contaminación de dieta. No se encontró relación alguna entre la partícula Bp15.1PLP y la toxicidad frente a este insecto. Este estudio supone un paso más en la caracterización de la cepa entomopatógena B. pumilus 15.1, cuyo principal factor de virulencia responsable de la toxicidad hacia larvas de C. capitata continúa siendo desconocido.