Study of the mitochondria as a new therapeutic target against head and neck cancer: evaluation of melatonin effects

Abstract

El carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) es uno de los cánceres más comunes a nivel mundial. Sin embargo, a pesar de los avances realizados en cuanto a tratamientos y técnicas de diagnóstico, la tasa de supervivencia continúa siendo del 50%. Una de las principales causas es la resistencia que acaban desarrollando los pacientes a los tratamientos ya existentes, lo que conlleva a un elevado porcentaje de recaídas. Por ello, sigue siendo necesaria la búsqueda de nuevos fármacos y dianas terapéuticas que potencien los efectos de los tratamientos ya existentes y reduzcan sus efectos adversos. Una posible diana terapéutica serían las especies reactivas de oxígeno (ROS), un grupo de moléculas altamente reactivas que actúan en distintas rutas de señalización en las células sanas y que, a su vez, están implicadas en el desarrollo de ciertas patologías como el cáncer. En este sentido, las células tumorales presentan un balance redox alterado en comparación con las células normales. Por tanto, una posible estrategia antitumoral sería aumentar directamente los niveles de ROS, así como disminuir la capacidad antioxidante de las propias células tumorales, induciendo la muerte celular programada. En este ámbito es donde destaca la melatonina ya que, además de poseer importantes propiedades oncostáticas, numerosos estudios han demostrado su capacidad para regular la producción de ROS, tanto en células sanas como en tumorales. En este sentido, se ha demostrado que la melatonina tiene un efecto dual, disminuyendo el estrés oxidativo en las células sanas y aumentándolo en las células tumorales. Sin embargo, aunque se conoce el mecanismo de acción de la melatonina para disminuir los ROS en las células sanas, al día de hoy se desconoce el mecanismo de esta molécula para ejercer un efecto pro-oxidante en las células tumorales, lo que dificulta su uso como tratamiento oncostático. Por tanto, el objetivo de este trabajo fue dilucidar el mecanismo de acción de la melatonina para inducir la producción de ROS en células de cáncer de cabeza y cuello. Para ello, analizamos los efectos de la melatonina en las líneas celulares HNSCC (Cal-27 y SCC-9) tratadas con melatonina a 0,5 y 1 mM. Además, comprobamos los efectos pro-oxidantes y pro-apoptóticos de la melatonina in vivo, en ratones nude atímicos con xenoinfertos de células Cal-27. Medimos la producción de ROS mediante métodos fluorométricos y los niveles de apoptosis mediante citometría de flujo en las células HNSCC, en presencia de Nacetilcisteína (NAC) y de inhibidores mitocondriales. Se analizaron diferentes parámetros mitocondriales tales como expresión de OXPHOS por western blot, actividad de los complejos mitocondriales (CI-CV) por análisis espectrofotométricos, respiración mitocondrial por SeaHorse y con electrodo de oxígeno Clark y niveles de ATP mediante técnicas espectofotométricas. Asimismo, se estudiaron los niveles de CoQ por cromatografía líquida acoplada a espectrómetro de masas (UPLC-MS/MS), el potencial de membrana mitocondrial por métodos fluorimétricos y las expresiones de las UCPs por western blot. También realizamos un estudio de metabolómica mediante UPLCMS/ MS, así como un análisis de la conformación de los supercomplejos mitocondriales mediante electroforesis en gel nativo azul. Finalmente, comprobamos los efectos apoptóticos y pro-oxidantes de melatonina in vitro en las células Cal-27 que tenían inducida la expresión de la proteína oxidasa alternativa (AOX), mediante el uso de lentivirus, así como in vivo en xenotrasplantes con las células que sobreexpresan la proteína AOX. Esta proteína evita la producción de ROS a través del transporte inverso de electrones (RET). En este trabajo demostramos que la melatonina, al inducir el transporte inverso de electrones que conlleva a un aumento de los niveles de ROS, tiene un efecto proapoptótico en células de cáncer de cabeza y cuello. Concretamente, la melatonina indujo un cambio en el metabolismo tumoral y un aumento de la actividad mitocondrial, provocando, en dichas células tumorales, un aumento de los niveles de ROS inducido por un desacoplamiento del sistema de transporte electrónico y de la fosforilación oxidativa. Sorprendentemente, los distintos inhibidores de los complejos mitocondriales, incluida la rotenona, bloquearon el efecto pro-oxidante de la melatonina, lo que indica que la melatonina aumenta los niveles de ROS a través del transporte inverso de electrones. En este sentido, la melatonina también aumentó el potencial de membrana y el coeficiente CoQ10H2/CoQ10, que son dos condiciones imprescindibles para la generación de RET-ROS. Por último, demostramos que la manipulación genética de las células Cal-27 que expresan la oxidasa alternativa, la cual transfiere electrones de la coenzima QH2 al oxígeno, inhibió la generación de ROS y apoptosis inducidos por el tratamiento con melatonina, destacando la importancia del RET como el causante de la producción de ROS. Estos resultados demuestran que la producción de RET-ROS es un factor crucial en los efectos de la melatonina en las células tumorales y establecen el efecto dual de la melatonina en la protección de las células normales y la inducción de la apoptosis en las células tumorales. Nuestros resultados demuestran, por primera vez, que la melatonina a altas dosis induce un amento de los niveles de ROS, a través del transporte inverso de electrones, lo que conlleva a un aumento de la muerte celular programada en las células Cal-27 y SCC-9. Por tanto, estos resultados dilucidan el mecanismo de acción prooxidante de la melatonina en células tumorales, lo que facilita su posible uso en futuras aplicaciones oncológicas.

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is one of the most common cancer by incidence worldwide. Despite therapeutic and diagnostic advances, survival rates are still only about 50%. Drug resistance and relapse are the principal limitations of clinical oncology for many patients. It is therefore crucial to find new therapeutic targets and drugs to enhance the cytotoxic effects of conventional treatments without potentiating the adverse effects. Reactive oxygen species (ROS) constitute a group of highly reactive molecules that have involved as regulators of important signaling pathways, but they are also involved in some pathologies such as cancer. In this context, tumor cells have an altered redox balance compared to normal cells, which can be targeted as an antitumoral therapy by increasing ROS levels and by decreasing the capacity of the antioxidant system, leading to programmed cell death. Regarding that, melatonin is of particular importance in the development of innovative cancer treatments due to the regulation of ROS production in both normal and cancer cells. It has been demonstrated that melatonin has a dual effect, reducing ROS production in normal cells but increasing them in tumoral cells. However, despite the antioxidant effect of melatonin in normal cells has been described, the pro-oxidant mechanism of action of melatonin in tumoral cells remains unclear, which has hindered its use in clinical treatments. In the present study, we aimed to elucidate the mechanism of action of melatonin to induce ROS production in in head and neck squamous cancer cells. We analyzed the effects of melatonin on HNSCC cell lines (Cal‐27 and SCC‐9), which were treated with 0.5 or 1mM melatonin. We further examined the potential effects of melatonin to induce ROS and apoptosis in Cal‐27 xenograft mice. We measured ROS production using fluorometric methods and apoptosis levels by flow cytometry in HNSCC cells alone or in presence of N-acetyl cysteine (NAC) and mitochondrial inhibitors. In addition, we analyzed some mitochondrial parameters, such as: OXPHOS expression by Western Blot, mitochondria complex (CI–CV) activity by spectrophotometric analysis, mitochondrial respiration by SeaHorse and with a Clark oxygen electrode, and ATP levels by spectrophotometric technics. Likewise, CoQ levels by liquid chromatography–mass spectrometer (UPLC-MS/MS), mitochondrial membrane potential by fluorimetric methods and UCPs expressions by western blot were studied. We also performed a metabolomics study by UPLC-MS/MS, as well as an analysis of mitochondrial supercomplexes conformation by blue native gel electrophoresis (BNGE). Finally, we tested melatonin pro-oxidant and apoptotic effects in vivo in Cal-27 expressing alternative oxidase (AOX) protein, which avoid reverse electron transport (RET) ROS production, and in vivo inducing Cal‐27 wild type and Cal- 27 expressing AOX xenograft mice. We demonstrated that melatonin mediates apoptosis in head and neck cancer by driving mitochondrial reverse electron transport (RET) to induce ROS production. Melatonin‐induced changes in tumoral metabolism and increased mitochondrial activity which, in turn, induced ROS‐dependent mitochondrial uncoupling. Interestingly, mitochondrial complex inhibitors, including rotenone, abolished the ROS elevation indicating that melatonin increased ROS generation via RET. Melatonin also increased the membrane potential and CoQ10H2/CoQ10 ratio to elevate mitochondrial ROS production, which are essential conditions for RET. We found that genetic manipulation of Cal-27 cells with alternative oxidase, which transfers electrons from QH2 to oxygen, inhibited melatonin‐induced ROS generation, and apoptosis, highlighting the importance of RET as the site of ROS production. These results illustrate that RET and ROS production are crucial factors for melatonin's effects in cancer cells and establish the dual effect of melatonin, to protect normal cells and to induce apoptosis in cancer cells. Our data show, for the first time, that melatonin induces ROS complex I RET and leads to apoptosis from excessive ROS production, only at high doses, in Cal-27 and SCC9 cells. This pathway clarifies the proposed mechanism of action of melatonin inducing ROS production in cancer cells in order to propose future anti-neoplastic clinical applications.