Efectos fisiológicos y productivos del estrés por calor en el cerdo ibérico y posibles estrategias nutricionales para mitigarlo

Abstract

El cambio climático es una de las principales amenazas a la que se enfrenta la sociedad en el siglo XXI, causando un aumento en la frecuencia de las olas de calor e incrementando la temperatura global del planeta. La temperatura ambiental óptima para el ganado porcino está en el intervalo 18-25 °C, provocando por encima de dicho intervalo una situación de estrés por calor, lo que supone problemas de bienestar animal y considerables pérdidas económicas para el sector ganadero. Además, los cerdos son muy susceptibles a sufrir el estrés por calor puesto que tienen pocas glándulas sudoríparas funcionales y presentan una gruesa capa subcutánea de tejido adiposo. Sin embargo, a pesar de la importancia que tiene conocer cómo afecta el estrés por calor al cerdo ibérico, no existen estudios sobre este tema, hasta el realizado en la presente tesis doctoral. El objetivo general de esta tesis doctoral ha sido determinar los efectos del estrés por calor sobre los parámetros productivos y de la calidad de la carne del cerdo ibérico, así como estudiar diferentes aspectos de su metabolismo. Además, nos propusimos también ensayar la suplementación con Zn y con betaína como posibles estrategias nutricionales para mitigar o prevenir las consecuencias negativas de dicho estrés sobre los aspectos objeto de estudio. Para lograr estos objetivos principales se plantearon los siguientes objetivos específicos: a) analizar la ingestión de alimento, el crecimiento, la eficiencia alimentaria y el rendimiento de las piezas de la canal; b) estudiar los parámetros metabólicos del cerdo ibérico, analizando parámetros bioquímicos sanguíneos y evaluando la capacidad fermentativa intestinal; c) determinar la composición nutricional y parámetros de calidad de la carne en dos músculos (Longissimus lumborum y Gluteus medius) y su relación con marcadores de estrés oxidativo; d) evaluar el efecto de la suplementación con Zn en la daño a la barrera intestinal ocasionado por el estrés por calor, mediante la utilización de la línea celular Caco-2. Para conseguir los objetivos descritos se realizaron un experimento in vivo y dos experimentos in vitro. En el ensayo in vivo se determinaron los diferentes parámetros productivos (ingestión de alimento, velocidad de crecimiento, eficiencia en la utilización de alimento, rendimiento de las piezas de la canal, peso de los órganos) y se recogieron muestras que permitiesen estudiar aspectos relacionados con el metabolismo (plasma para analizar parámetros bioquímicos, contenido del recto para evaluar la capacidad fermentativa in vitro) y la calidad de la carne (músculos Longissimus lumborum y Gluteus medius para determinar la composición nutricional y parámetros de calidad). En el experimento in vivo se utilizaron 40 cerdos ibéricos puros machos castrados de 43,8 ± 0,97 kg de peso vivo (PV) inicial, proporcionados por Sánchez Romero Carvajal Jabugo, S.A, (Puerto de Santa María, España). Tras un periodo de adaptación de 7 días a las instalaciones, los animales fueron asignados a uno de los cinco tratamientos experimentales: 1) Termoneutralidad (20 °C) y alimentados ad libitum con dieta control (TN-CON-AL); 2) Estrés por calor (30 °C) y alimentados ad libitum con dieta control (EC-CON-AL); 3) Termoneutralidad y alimentados a la par respecto al grupo sometido a estrés por calor (TN-CON-AP); 4) Estrés por calor y alimentados ad libitum con una dieta suplementada con betaína (EC-BET-AL); 5) Estrés por calor y alimentados ad libitum con una dieta suplementada con zinc (EC-Zn-AL). El experimento tuvo una duración de 28 días. La dieta experimental que se utilizó estaba compuesta por soja, maíz y cebada y suplementada con aminoácidos esenciales para mantener un perfil adecuado que cubriese todas las necesidades nutricionales. La dieta control fue suplementada con betaína (5 g/kg) o zinc (120 mg/kg, con SO4Zn). Los datos proporcionados por este ensayo indicaron que el estrés por calor redujo la ingestión voluntaria de alimento en un 20 %, lo que tuvo un efecto directo en el crecimiento de los animales, aunque en general más moderado que el descrito previamente en las razas mejoradas. No encontramos diferencias en la eficiencia de transformación de alimento debidas al calor. En cuanto al peso de los órganos, observamos que en los animales sometidos a estrés por calor el peso de los riñones y del páncreas fue menor en comparación con los del grupo TNCON- AL. Respecto a los componentes de la canal, encontramos que la exposición a elevadas temperaturas provocó una disminución en el peso de la canal en comparación con el grupo de termoneutralidad ad libitum. En el caso del jamón, lomo y solomillo observamos una disminución del peso bajo condiciones de estrés por calor al comparar con los animales en termoneutralidad, tanto alimentados ad libitum como a la par, lo que indica que el efecto se debe al calor per se, y no a la reducción del consumo de alimento. En cuanto a la betaína, aumentó el peso relativo del solomillo en los animales sometidos a estrés por calor, mientras que en el caso del Zn no observamos ningún efecto en los componentes de la canal. El estudio de la bioquímica sanguínea mostró que en los animales sometidos al calor se produjo un incremento de creatinina, lo que puede estar relacionado con un mayor catabolismo proteico en estos animales y a su vez, con el bajo peso de los cortes más magros de la canal observados en el presente ensayo. También aumentó el nitrógeno ureico plasmático, lo que sugiere una menor eficiencia del uso del nitrógeno en situaciones de calor prolongado. Además, en estas condiciones se detectó un incremento de la glucosa plasmática, aunque no se observaron cambios en la insulina ni en la sensibilidad a la insulina. Sin embargo, el índice HOMA-%B disminuyó en los animales expuestos al calor, lo que podría indicar un deterioro funcional de las células β pancreáticas. La suplementación con Zn y betaína en cambio, mejoró la función de las células β medida mediante el índice HOMA-%B y en paralelo provocó una disminución en la glucosa plasmática. Para evaluar el efecto del estrés por calor sobre la fermentación intestinal realizamos un experimento in vitro utilizando como inóculo de fermentación las heces de los animales de los grupos sometidos a diferentes temperaturas, pero con el mismo consumo de alimento (TN-CONAP y EC-CON-AL), que se incubaron con diferentes sustratos (una mezcla de almidones, pectina, inulina y celulosa). La incubación con pectina generó la mayor producción de acetato en comparación con los otros sustratos. La mezcla de almidones mostró una elevada producción de butirato, un ácido graso volátil que se asocia con efectos beneficiosos para la salud del intestino grueso. En cuanto a la celulosa, mostró tener una producción de gas y una producción total de ácidos grasos volátiles baja, indicando que había una presencia reducida de microbiota celulolítica. La fermentación de inulina y la mezcla de almidones dio lugar a una baja concentración de amonio y producción de isoácidos, lo que indica una reducción en la fermentación proteica con estos sustratos. Es de resaltar que los cerdos sometidos a estrés por calor presentaron una mayor producción de ácidos grasos volátiles totales, lo que puede suponer una ventaja puesto que promueven la resistencia a patógenos oportunistas, y en la producción de acetato y propionato. Un incremento en la producción de isoácidos y en la concentración de amonio probablemente indiquen un aumento en la fermentación bajo condiciones de estrés por calor. También, el estrés por calor disminuyó la relación acetato:propionato, indicando un incremento en la disponibilidad de energía proveniente de la fermentación. Para estudiar el efecto del estrés por calor en la calidad de la carne, se seleccionaron los músculos Longissimus lumborum y Gluteus medius, por ser músculos de diferente metabolismo (el primero más glucolítico y el segundo más oxidativo) y representativos de las piezas comerciales más valoradas por productores y consumidores. Los resultados mostraron que en los animales en estrés por calor aumentó la concentración de grasa intramuscular en comparación con los alimentados a la par en termoneutralidad, compensando el descenso de grasa intramuscular debido a la menor ingesta. El perfil de ácidos grasos fue relativamente estable en los cerdos sometidos a estrés por calor en comparación con los animales de termoneutralidad, encontrándose solamente una menor concentración de ácidos grasos n3 y una menor relación PUFA/SFA en el Gluteus medius. La exposición al calor no afectó al pH de la carne ni a su característico color rojo, pero sí mejoró la luminosidad de los músculos y la capacidad de retención de agua, factor estrechamente relacionado con características sensoriales como la terneza y la jugosidad. En contra de lo descrito anteriormente para razas blancas, el calor prolongado no supuso una situación de estrés oxidativo en los músculos de los cerdos ibéricos. La aparente ausencia de daño oxidativo (marcada por la estabilidad en los niveles de MDA en los músculos de los animales en estrés térmico) podría estar mediada por una estimulación del sistema de defensa enzimático (catalasa y superóxido dismutasa especialmente), que consiguió mitigar el probable daño inicial inducido por el calor. Por lo tanto, nuestros resultados mostraron que el estrés térmico sufrido por los cerdos ibéricos no comprometió la calidad de la carne, sino que incluso mejoraron algunos marcadores, como la concentración de grasa intramuscular, la luminosidad o la capacidad de retención de agua y, además, no se observó ningún deterioro oxidativo. El consumo de la dieta suplementada con Zn mejoró la capacidad de retención de agua tras la cocción y la descongelación de la carne, y producjo algunos cambios significativos en las coordenadas de color, como el aumento de L* y la disminución de a* (rojez) en el Gluteus medius, probablemente relacionada con la menor concentración de hierro en este músculo.Con esta dieta, observamos una mejora en la respuesta frente al estrés oxidativo en el músculo Longissimus lumborum, marcada por un incremento en la actividad de la enzima glutatión peroxidasa y en los niveles de antioxidantes. Sin embargo, con la dieta de betaína no observamos ningún cambio. Para evaluar el efecto preventivo de la suplementación con Zn (50 y 100 μM) frente al daño térmico en la barrera intestinal utilizamos la línea celular Caco-2. El primer indicador que estudiamos fue el daño celular (la viabilidad celular y el daño a la membrana mediante la liberación de LDH). La preincubación con Zn antes de inducir un estrés térmico moderado (24 h a 41 °C) mejoró la proliferación celular en comparación con las células que no tenían Zn en el medio de cultivo, aunque esta mejora disminuyó cuando el estrés por calor fue más severo (42 °C). Además, la suplementación con Zn durante 24 h tuvo efectos positivos sobre la integridad celular, reduciendo la liberación de LDH tanto en condiciones de termoneutralidad como bajo un estrés por calor, excepto a altas concentraciones de Zn (100 μM) y bajo un calor severo (42 °C). El estudio de los marcadores antioxidantes (generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y actividad de enzimas antioxidantes) indicó que el tratamiento con Zn tuvo un efecto preventivo en el estatus oxidativo de la célula en situaciones de estrés por calor, ya que en estas condiciones se redujo la generación de ROS y se estimuló la actividad de las enzimas antioxidantes. También estudiamos el efecto del Zn en la integridad de la barrera intestinal (la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) y la permeabilidad de la membrana al rojo fenol). Una preincubación con Zn durante 24 h fue efectiva para paliar parcialmente el efecto perjudicial que ejercen las elevadas temperaturas en la barrera intestinal, puesto que el Zn (50 μM) incrementó los valores de TEER durante un calentamiento a 41 °C y ambas concentraciones de Zn mejoraron la integridad de la barrera si el calor era de 42 °C. Además, la preincubación con Zn en concentraciones moderadas (50 μM) antes de someter a las células a 41 y 42 °C mejoró la permeabilidad intestinal, indicada por la reducción en el paso del rojo fenol a través de la monocapa celular.

Climate change is one of the main threats for society in the 21 st century, causing an increase in the frequency of heat waves and in the global temperature of the planet. The comfort temperature for pigs is in the range of 18-25 °C, and temperatures above 25 cause heat stress, which entails decreased animal welfare and considerable economic losses for the livestock sector. Furthermore, pigs are very susceptible to heat stress because they have few functional sweat glands and a thick subcutaneous layer of adipose tissue. Nevertheless, contrary to modern breeds, there is scarce information on how heat stress affects the Iberian pig. The general objective of this PhD thesis is to determine the effects of heat stress on the productive parameters and meat quality of Iberian pigs, as well as on different aspects of their metabolism. In addition, we have used Zn and betaine supplementation as possible nutritional strategies to mitigate or prevent the negative consequences of heat stress on the aspects under study. To achieve these main objectives, the following specific objectives were proposed: a) to determine feed intake, growth, feed efficiency and carcass characteristics; b) to study metabolic parameters of the Iberian pig, analyzing plasma biochemical parameters and evaluating hind gut fermentative capacity; c) to determine the nutritional composition and meat quality parameters in two muscles (Longissimus lumborum and Gluteus medius) and their relationship with markers of oxidative stress; d) to evaluate the effect of Zn supplementation on damage to the intestinal barrier caused by heat stress, using the Caco-2 cell line. To achieve the objectives, one in vivo experiment and two in vitro experiments were carried out. In the in vivo trial, growth parameters (feed intake, growth rate, feed efficiency, organs weight), plasma biochemical profile, carcass characteristics and meat quality (nutritional composition and quality parameters of Longissimus lumborum and Gluteus medius muscles) were determined. The in vivo experiment used 40 castrated male purebred Iberian pigs (Sanchez Romero Carvajal strain) of 43.8 ± 0.97 kg initial body weight (BW). After a 7-day adaptation period, the animals were randomly assigned to one of the five experimental treatments: 1) Thermoneutrality (20 °C and fed ad libitum with control diet (TN-CON-AL); 2) Heat stress (30 °C) and fed ad libitum with control diet (HS-CON-AL); 3) Thermoneutrality and pair fed to achieve similar intake than HSCON- AL (TN-CON-PF); 4) Heat stress and fed ad libitum with betaine supplemented diet (HS-BETAL); 5) Heat stress and fed ad libitum with zinc supplemented diet (HS-Zn-AL). The experiment had a duration of 28 days. The experimental diets were barley-soy bean meal based and supplemented with essential amino acids to maintain an adequate amino acid profile and cover all nutrient requirements and were either unsupplemented or supplemented with betaine (5 g/kg) or zinc (120 mg/kg, with SO4Zn). Heat stress reduced voluntary feed intake by 20 %, which had a direct negative effect on animal growth, although more moderate than previously described in modern breeds. We found no differences in feed efficiency due to heat stress. Regarding organs weight, the weight of kidneys and pancreas was lower in animals subjected to heat stress compared those fed ad libitum under thermoneutrality. Regarding carcass components, exposure to elevated temperatures caused a decrease in carcass weight compared to the thermoneutrality group fed ad libitum. Tenderloin, loin, ham and ribs weight decreased under heat stress conditions compared to animals raised in thermoneutrality, both ad libitum and pair fed, indicating that the reduction was independent of feed intake. As for betaine, it increased the relative weight of the tenderloin in the animals subjected to heat stress, while in the case of Zn we observed no effect on the carcass components. An increase in plasma creatinine was observed in the animals subjected to heat stress, which may be related to a greater protein catabolism in these animals. Plasma urea nitrogen increased, suggesting a lower efficiency of nitrogen utilization in situations of prolonged heat stress. In addition, an increase in plasma glucose was detected under heat stress, although no changes on insulin or insulin sensitivity were observed. However, the HOMA-beta index decreased in heat-exposed animals, which could indicate a functional impairment of pancreatic β-cells. However, Zn and betaine supplementation improved β-cell function and decreased plasma glucose. To evaluate the effect of heat stress on intestinal fermentation, we performed an in vitro experiment using as inoculum the feces of animals from groups subjected to different temperatures, but with the same feed intake (TN-CON-AP and EC-CON-AL), which were incubated with different substrates (a mixture of starches, pectin, inulin and cellulose). Incubation with pectin generated the highest acetate production compared to the other substrates. The starch mixture showed a high production of butyrate, a volatile fatty acid that is associated with beneficial effects on the health of the large intestine. As for cellulose, it showed low gas production and low total volatile fatty acid production, indicating that there was a low presence of cellulolytic microbiota. Fermentation of inulin and mixed starches resulted in low ammonium concentration and isoacid production, suggesting a reduction in protein fermentation with these substrates. We also found low acetate: propionate ratio, showing an increase in energy availability from fermentation. It is noteworthy that heat-stressed pigs had a higher production of total volatile fatty acids, which may be an advantage since they promote resistance to opportunistic pathogens, including enterobacteria. To study the effect of heat stress on meat quality, Longissimus lumborum and Gluteus medius muscles were selected, since they are muscles with different metabolism (the former more glycolytic and the latter more oxidative) and representative of the commercial pieces most valued by producers and consumers. Heat stress increased intramuscular fat content in Iberian pigs compared with those pair fed in thermoneutrality. The fatty acid profile was relatively stable in heat-stressed pigs compared to animals in thermoneutrality. Exposure to heat stress did not affect meat pH and its typical red color, but did improve muscle brightness and water holding capacity, a factor closely related to sensory characteristics such as tenderness and juiciness. Contrary to what was previously described for conventional breeds, prolonged heat did not cause oxidative stress in the muscles of Iberian pigs. The absence of oxidative damage (stable MDA levels) in the muscles of heat-stressed animals could be mediated by a stimulation of the enzymatic defense system (catalase and superoxide dismutase). Therefore, our results showed that heat stress in Iberian pigs did not compromise meat quality, but improved intramuscular fat content, brightness and water retention capacity and, in addition, no oxidative deterioration was observed. The consumption of the Zn-supplemented diet improved water retention capacity after cooking and thawing of the meat, and produced some significant changes in the color coordinates, such as an increased L* and decreased a* (redness) in the Gluteus medius, probably related to the lower iron concentration in the muscle. Dietary Zn supplementation improved the response to oxidative stress in the Longissimus lumborum muscle, as indicated by an increase in the activity of glutathione peroxidase and in the levels of antioxidants. However, betaine supplementation did not alter meat quality in any of the muscles studied. To evaluate the protective effect of Zn supplementation (50 and 100 μM) against thermal damage in the intestinal barrier we used the Caco-2 cell line. The first indicator we studied was cell damage (cell viability and membrane damage through LDH release). Preincubation with Zn before inducing moderate heat stress (24 h at 41 °C), improved cell proliferation compared to cells without Zn in the culture medium. However, this improvement decreased when heat stress was more severe (24 h at 42 °C). In addition, Zn supplementation for 24 h had positive effects on cell integrity, reducing LDH release both under thermoneutral conditions and under heat stress, except at high Zn concentrations (100 μM) and under severe heat (42 °C). The study of antioxidant markers (reactive oxygen species (ROS) generation and antioxidant enzyme activity) indicated that Zn had a preventive effect on the oxidative status of the cell in heat stress situations, since the generation of ROS was reduced and the activity of antioxidant enzymes was stimulated. Also, we studied the effect of Zn on intestinal barrier integrity (transepithelial electrical resistance (TEER) and membrane permeability to phenol red). A preincubation with Zn for 24 h was effective in alleviating the detrimental effect exerted by elevated temperatures on the intestinal barrier, since Zn increased TEER values at 41 °C (50 μM) and at 42 °C. In addition, preincubation with 50 μM Zn previous to exposure at 41 and 42 °C improved intestinal permeability, as indicated by the reduction in the passage of phenol red through the cell monolayer.