Papel del enhancer del gen de la cadena α del receptor de linfocitos T en la expresión del gen reordenado

Abstract

Los linfocitos T αβ expresan en su superficie un receptor para antígeno denominado receptor de linfocitos T (TCR) formado por dos cadenas variables, TCRα y TCRβ, y una serie de cadenas invariables pertenecientes al complejo CD3. Los genes que codifican por las cadenas TCRα y TCRβ están formados por segmentos génicos dispersos en el genoma que necesitan reordenarse para dar lugar a una configuración génica capaz de generar un ARN mensajero que pueda traducirse en una proteína funcional. Por lo tanto, estos genes existen en dos configuraciones distintas: no reordenada y reordenada. Para que se den estos reordenamientos es necesario que se active la transcripción no codificante del gen no reordenado o transcripción germinal a través de la acción de potenciadores transcripcionales (enhancers) y promotores asociados a los segmentos génicos. El enhancer del gen de la cadena TCRa, Eα, se activa durante el paso de timocitos dobles negativos (DN), denominados así por no expresar los marcadores de superficie CD4 y CD8, a timocitos dobles positivos (DP), denominados así por expresar ambos marcadores en superficie. Eα es esencial para activar la transcripción germinal y la recombinación VaJa de este gen. Experimentos previos de nuestro laboratorio compararon la actividad de Eα para activar la transcripción germinal del gen Tcra en timocitos DP y en linfocitos T αβ, y mostraron que su actividad está fuertemente reducida en estos últimos, siendo esta inhibición irreversible durante la proliferación y diferenciación de los linfocitos maduros. A pesar de que Eα se encuentra fuertemente inhibido, no se observó ninguna caída en la transcripción del gen Tcra reordenado en linfocitos T αβ frente a su transcripción en el contexto del gen no reordenado en timocitos DP, lo cual sugirió que Eα podría no estar implicado en la transcripción del gen o que requiere de la colaboración de otras secuencias distales para mantener la transcripción génica en el contexto del gen reordenado. Nuestros datos indican que Eα es necesario para la transcripción del gen reordenado de la cadena TCRα y la expresión del TCRαβ en membrana de los linfocitos T αβ, tanto en ratones como en humanos. Para la transcripción ficiente del gen Tcra reordenado y la expresión del TCRab en linfocitos T, este enhancer necesita colaborar con otras secuencias no presentes dentro del transgén Tcra DO11.10, el cual consiste en el mayor transgén Tcra que existe y contiene una región de 33,5 kilobases que va desde Traj13 hasta el tercer exón del gen vecino Dad1. La posición génica de Ea se encuentra en el límite entre dos sub-dominios asociados topológicamente (sub-TAD): 5´sub-TAD de 525 kilobases, constituido por secuencias del gen Tcra, y 3´sub-TAD de 400 kilobases, constituido por los genes que van desde Dad1 a Cdh24. Con el fin de identificar las secuencias que colaboran con Eα en el contexto del gen Tcra reordenado en linfocitos T αβ, hemos realizado estudios comparativos de las interacciones genómicas que ocurren entre determinadas secuencias del gen Tcra con el 5´sub-TAD y el 3´sub-TAD, tanto en el contexto del gen Tcra no reordenado en timocitos DP como en el contexto del gen Tcra reordenado en linfocitos T αβ mediante 4C-seq. Las secuencias utilizadas como anzuelo fueron seleccionadas en función de su localización genómica y de la accesibilidad de su cromatina en el paso de timocitos DP a linfocitos T αβ según análisis de ATAC-seq. Como era esperable, se observó que Eα establece fuerte interacciones con el 5´sub-TAD en el contexto del gen Tcra no reordenado en timocitos DP, las cuales se pierden tras la recombinación del gen en linfocitos T αβ. Además, se observó que Ea establece interacciones con regiones del 3´sub-TAD en ambos contextos génicos y tipos celulares. Estos análisis también identificaron que la secuencia denominada Cα peak, situada dentro de una región intrónica del dominio constante del gen Tcra, actúa junto con Eα en las interacciones observadas con el 5´sub-TAD en timocitos DP en el contexto del gen Tcra no reordenado, y también con el 3´sub-TAD tanto en el contexto del gen Tcra no reordenado en timocitos DP como en el contexto del gen Tcra reordenado en linfocitos T αβ. El análisis cuantitativo de los datos por 4C-ker indicó que las interacciones genómicas de Eα y Ca peak, tanto de forma conjunta como por separado, son más fuertes en el contexto del gen Tcra reordenado en linfocitos T αβ que en el contexto del gen Tcra no reordenado en timocitos DP. Estos datos indican que tanto Eα como Cα peak participan en la formación de un nudo de cromatina en el 5´sub-TAD en el contexto del gen Tcra no reordenado en timocitos DP, como en el fortalecimiento de un nudo de cromatina en el 3´sub-TAD en el contexto del gen Tcra reordenado en linfocitos T αβ respecto al existente en el contexto del gen Tcra no reordenado en timocitos DP. Puesto que los reordenamientos VαJα en linfocitos T αβ no inducen nuevas interacciones de largo alcance entre Eα y Ca peak y otras regiones genómicas que permanecen en cis tras la recombinación, las interacciones fuertes que se observan entre Eα y Ca peak con el 3´sub-TAD podrían prevenir la reducción de la transcripción del gen Tcra reordenado que sería esperable tras la inhibición de la función de Eα que se observa en linfocitos T ab.