Characterization of cellular phenotype and proinflammatory response in Meniere’s Disease

Abstract

Meniere Disease (MD) is a chronic inner ear syndrome, characterized by spontaneous episodes of vertigo associated with fluctuating hearing loss, tinnitus and aural fulness. The pathological mechanisms leading to MD are poorly understood, yet genetics and autoimmunity/inflammation seem to be the leading hypotheses for its development. Various studies have described MD subtypes, according to clinical, image and molecular characteristics, namely a subset of MD with increased proinflammatory cytokine production has been described. It has also been shown that MD patients show an increase in proinflammatory cytokines after antigenic stimulation with mould extracts. So, we hypothesize that some fungal proteins and/or other allergens might initiate MD. Therefore, we proposed to investigate the role of antigenic stimulation and the mechanism of proinflammatory response in MD. For this, we would determine the cellular subsets involved in the basal and post antigenic stimulation pro-inflammatory response in MD patients with low and high levels of proinflammatory cytokines; and describe autoimmune/autoinflammatory variants of MD through methylome and transcriptome analysis. A total of 194 MD patients, 84 VM patients and 95 controls were included in this study. To determine the major differences between MD, VM and controls, a panel of 25 cytokines was measured through multiplex-ELISA and gene expression array was performed. Immunophenotyping through mass cytometry was performed on whole blood, at basal levels and after antigenic stimulation with Aspergillus niger (ASP), lipopolysaccharide (LPS) and dexamethasone (DEX). Differences in abundance and state were evaluated before and after stimulations. Methylome analysis, through whole genome bisulphite sequencing was performed on DNA extracted from PBMC. RNAseq was used to analyse the transcriptome. For the methylome and transcriptome results, enrichment analysis were performed. Our findings show that: (1) the quantification of IL-1β, CXCL1, CCL3 and CCL22 levels can allow to distinguish MD from VM patients. (2) MD has a difference in the abundance of granulocytes, T-cells and CD56dim NK-cells and can be separated into two clusters according to the cytokine profile. (3) Aspergillus niger did not provoke a different response between MD and controls and cannot be considered a trigger of MD. (4) MD patients show a different methylation profile from controls. (5) RNAseq distinguished two patient groups, that seem to have different immune background, but are clinically similar. Together, these results show that MD includes various endophenotypes, according to cytokine profile and immune cell subpopulations, methylation profile and transcriptome profile.

La enfermedad de Meniere (EM) es un síndrome crónico del oído interno, caracterizado por episodios espontáneos de vértigo asociados a hipoacusia fluctuante, acufenos y plenitud ótica. Los mecanismos patológicos que conducen a la EM son poco conocidos, aunque la genética y la autoinmunidad/inflamación parecen ser las principales hipótesis para su desarrollo. Varios estudios han descrito subtipos de EM, según sus características clínicas, de imagen y moleculares, concretamente se ha descrito un subgrupo de EM con una mayor producción de citoquinas proinflamatorias. También se ha demostrado que los pacientes con EM muestran un aumento de citoquinas proinflamatorias tras la estimulación antigénica con extractos fúngicos. Así, nuestra hipótesis es que algunas proteínas fúngicas y/u otros alérgenos podrían iniciar la EM. Por consiguiente, propusimos investigar el papel de la estimulación antigénica y el mecanismo de la respuesta proinflamatoria en la EM. Para ello, determinaríamos las subpoblaciones celulares implicados en la respuesta proinflamatoria basal y posterior a la estimulación antigénica en pacientes con EM con niveles bajos y altos de citoquinas proinflamatorias; y describiríamos las variantes autoinmunes/autoinflamatorias de la EM mediante el análisis del metiloma y del transcriptoma. En este estudio se incluyeron un total de 194 pacientes con EM, 84 pacientes con MV y 95 controles. Para determinar las principales diferencias entre la EM, la MV y los controles, se midió un panel de 25 citocinas mediante ELISA-multiplex y se realizó un array de expresión génico. El inmunofenotipado mediante citometría de masas se realizó en sangre total, en niveles basales y tras la estimulación antigénica con Aspergillus niger (ASP), lipopolisacárido (LPS) y dexametasona (DEX). Se evaluaron las diferencias de abundancia y de estado antes y después de las estimulaciones. El análisis del metiloma, a través de la secuenciación de bisulfito del genoma completo se realizó en el ADN extraído de células mononucleares. Se utilizó RNAseq para analizar el transcriptoma. Para los resultados del metiloma y el transcriptoma se realizaron análisis de enriquecimiento. Nuestros resultados muestran que: (1) la cuantificación de los niveles de IL-1β, CXCL1, CCL3 y CCL22 permiten distinguir a los pacientes con EM de los con MV. (2) La EM presenta una diferencia en abundancia de granulocitos, células T y células NK CD56dim y pueden separarse en dos grupos según el perfil de citoquinas. (3) El Aspergillus niger no provocó una respuesta diferente entre la EM y los controles y no puede considerarse un desencadenante de la EM. (4) Los pacientes con EM muestran un perfil de metilación diferente al de los controles. (5) El RNAseq distinguió dos grupos de pacientes, que parecen tener diferentes antecedentes inmunológicos, pero que son clínicamente similares. En conjunto, estos resultados muestran que la EM incluye varios endofenotipos, según el perfil de citoquinas y subpoblaciones de células inmunitarias, el perfil de metilación y el perfil transcriptómico.