Generación y evaluación de modelos biomiméticos de cáncer de piel no melanoma y de sustitutos bio-artificiales de nervio periférico para la evaluación de protocolos terapéuticos

Abstract

La ingeniería tisular tiene por objetivo básico la elaboración de tejidos artificiales, cada vez más biomiméticos y biocompatibles con los tejidos corporales. Estos tejidos artificiales pueden ser utilizados como herramienta terapéutica por sí misma para reparar, restaurar o incluso mejorar las funciones de tejidos y órganos dañados. Sin embargo, y además de la mencionada aplicación, los tejidos desarrollados por ingeniería tisular también pueden constituir una oportunidad para el estudio de enfermedades ex vivo, bajo condiciones controladas, gracias a la elaboración de modelos patológicos. En la presente Tesis Doctoral se plantea la generación de diversos tejidos artificiales, para, por un lado, recrear en el laboratorio modelos patológicos de cáncer de piel no melanoma y, por otro lado, reparar lesiones nerviosas a través de sustitutos bioartificales, siendo por sí mismos, herramientas terapéuticas. Ambos tejidos artificiales se elaboran gracias al biomaterial de fibrina-agarosa y, de esta forma, el mismo biomaterial es capaz de satisfacer las dos grandes aplicaciones que presentan los productos elaborados por ingeniería tisular. En este sentido, la incidencia del cáncer de piel ha aumentado en las últimas décadas siendo el cáncer de piel no melanoma, producido por la transformación de los queratinocitos de la epidermis, su principal representante. Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares que se asocian a la biología y la evolución del tumor, aún permanecen desconocidos. Es por ello, que en esta Tesis Doctoral se elaboraron modelos patológicos de cáncer de piel no melanoma que resultaron ser útiles para el estudio esta patología. El análisis histológico demostró que es posible recrear satisfactoriamente características propias de la diseminación tumoral gracias a este modelo. Se observó una rápida invasión de las células escamosas tumorales en el estroma acelular, así como una alta desorganización espacial con estructuras típicas tumorales en el epitelio del modelo con estroma celular. Estos resultados demostraron que los modelos generados no sólo pueden ser útiles para el estudio de la patología, sino que también se presentan como una alternativa para la evaluación de protocolos terapéuticos. Por otra parte, las lesiones de nervios periféricos provocan alteraciones en la función nerviosa y resultan en problemas físicos y psicológicos para los pacientes afectados. Actualmente, las lesiones nerviosas de gran longitud son reparadas gracias al uso de autoinjertos, el actual tratamiento de referencia, cuando éstos están disponibles. Sin embargo, es necesario encontrar alternativas eficientes al uso del autoinjerto para el tratamiento de defectos nerviosos críticos. Para dar respuesta a esta problemática clínica, en el desarrollo de esta Tesis Doctoral, se elaboraron sustitutos de nervio bioartificiales basados en hidrogeles de fibrina-agarosa nanoestructurados con células mesenquimales del tejido adiposo. Estos sustitutos nerviosos se utilizaron como herramienta terapéutica por sí mismos y, además, se combinaron con conductos de colágeno para la preparación de una lesión nerviosa de 10 mm en ratas. Los resultados in vivo demostraron que el sustituto de nervio bioartifical generó un mejor perfil de recuperación funcional que el mismo usado como conducto intraluminal en conductos de colágeno en un modelo de roedores. Dichos resultados se confirmaron posteriormente con estudios histológicos donde se apreció un activo proceso de regeneración en todos los grupos experimentales, mostrando de nuevo que el sustituto de nervio promueve una regeneración más activa y abundante que cuando el biomaterial se utiliza como relleno de un conducto de colágeno. Finalmente, los resultados experimentales obtenidos en esta Tesis Doctoral avalan la utilización del hidrogel de fibrina-agarosa para la generación tanto de modelos patológicos de enfermedad, como el cáncer de piel no melanoma, como para la generación de alternativas terapéuticas para la reparación de lesiones del nervio periférico, cumpliendo así las dos aplicaciones fundamentales de los productos generados por estrategias de ingeniería tisular.

Tissue engineering aims to develop artificial tissues that are increasingly biomimetic and biocompatible with body tissues. These artificial tissues can be used as a therapeutic tool by themselves to repair, restore or even improve the functions of damaged tissues and organs. However, in addition to the aforementioned application, tissues developed by tissue engineering can also constitute an opportunity for the study of diseases ex vivo, under controlled conditions, by the development of pathological models. This Doctoral Thesis proposes the generation of various artificial tissues, on the one hand, to recreate pathological models of non-melanoma skin cancer in the laboratory and, on the other hand, to repair nerve lesions by means of bioartificial substitutes that are themselves therapeutic tools. Both artificial tissues are made using the fibrin-agarose biomaterial and in this way, the same biomaterial is capable of satisfying the two major applications of tissue-engineered products. In this sense, the incidence of skin cancer has increased in recent decades, with non-melanoma skin cancer, produced by the transformation of keratinocytes in the epidermis, being its main representative. However, the cellular and molecular mechanisms associated with tumour biology and progression remain unknown. This is why, in this doctoral thesis, pathological models of non-melanoma skin cancer have been developed that are found to be useful for the study of the pathology. Histological analysis demonstrated that it is possible to successfully recreate features of tumour dissemination using this model. Rapid invasion of tumour squamous cells into the acellular stroma as well as high spatial disorganisation with typical tumour structures in the epithelium of the stromal cell model were generated. These results demonstrated that the generated models can not only be useful for the study of pathology, but also present an alternative for the evaluation of therapeutic protocols. On the other hand, peripheral nerve injuries cause disorders in nerve function and result in physical and psychological problems for affected patients. Currently, long nerve injuries are repaired using autografts, the current gold standard treatment, however, it is necessary to find efficient alternatives to the use of autografts for the treatment of critical nerve defects. In order to respond to this clinical problem, in the development of this Doctoral Thesis, bioartificial nerve substitutes based on nanostructured fibrin-agarose hydrogels with adiposederived mesenchymal stem cells were elaborated. These nerve substitutes were used as a therapeutic tool by themselves and were also combined with collagen conduits for the repair of a 10 mm nerve lesion in rats. In vivo results demonstrated that the bioartificial nerve substitute obtained a better functional recovery profile than the same one used as an intraluminal collagen conduit in rodents. These results are further confirmed by histological studies where an active regeneration process is confirmed in all experimental groups showing again that the bioartificial substitute used alone promotes a more active and abundant regeneration than the same one used as a collagen conduit filler. Finally, the experimental results obtained in this Doctoral Thesis support the use of the fibrin-agarose hydrogel for the generation of both, pathological models of diseases, such as non-melanoma skin cancer, and for the generation of therapeutic alternatives for the repair of nerve lesions, thus fulfilling the two fundamental applications of products generated by tissue engineering strategies.