Estudio de

Abstract

DNA guanine quadruplexes (G4s) are non-canonical structures formed through self-recognition of four guanines into stacked tetrads. G4s are highly prevalent at regulatory genomic regions. Considerable evidence has linked G4 formation with key biological processes ranging from telomere maintenance and transcription to genome instability and cancer. In particular, colorectal cancer (CRC) is the third most diagnosed cancer and constitutes the second leading cause of cancer death worldwide. New treatment options for CRC are required. To mimic the progression of CRC, we established a cellular model including non-tumoral, primary tumor and metastatic stages. Despite helicases involved in unwinding of G4s were overexpressed in CRC, stabilization of G4s and induction of DNA damage increased along CRC progression, both at G0/G1 and S phases. We identified a link between the presence of G4s and the accumulation of double-strand breaks in their vicinity. The folding status of G4s played a role in the abnormal gene expression of CRC-relevant genes such as CMYC. The G4 harbored in its promoter region did not contain any mutation. Several well-known G4 ligands induced cytotoxicity, but lacked selectivity for tumoral cells. In addition, we screened in CRC the antitumoral activity of several naphthalene-diimides (NDIs), a class of G4 ligands. We identified the leading compound T5 with a potent and selective inhibition of tumoral cell growth by high-affinity binding to G4s present in ribosomal DNA, thereby impairing RNA polymerase I (Pol I) elongation. Consequently, T5 induced a rapid inhibition of Pol I transcription, nucleolus disruption, proteasomedependent Pol I catalytic subunit A degradation, and autophagy. Moreover, we attributed the higher selectivity of carbohydrate-conjugated T5 for tumoral cells to its preferential uptake through the overexpressed glucose transporter 1. We succinctly demonstrated that T5 could be explored as a therapeutic agent in a patient cohort with CRC. Furthermore, we screened in CRC the antitumoral potential of several natural phenolic compounds. We selected gallic acid (GA) as candidate in terms of potency and selectivity. We reported on the role of GA as a G4 ligand explaining several of its antitumoral effects, including the transcriptional inhibition of ribosomal and CMYC genes. In addition, GA shared some effects with other established G4 ligands such as cell cycle arrest, nucleolar stress, and induction of DNA damage and autophagy. We further confirmed antitumoral and G4-stabilizing properties of GA in vivo using a xenograft model of CRC. Moreover, we concisely demonstrated that treatment with GA could be exploitable in a patient cohort with CRC. Finally, we generated a library of nanobodies targeting G4s through in vitro immunization. Nanobodies derive from heavy chain camelid antibodies by recombinant DNA technology. Although nanobodies displayed cross-reactivity with different G4 structures, specific CMYC G4- targeting nanobodies were enriched after phage-display biopanning. Overall, in this PhD thesis, we have analyzed G4 involvement in colorectal carcinogenesis, and we have investigated the therapeutic potential of several G4 ligands in CRC. We have disclosed a mode of action for NDIs that involves ribosomal G4s targeting, and that GA affects gene expression by interaction with G4s both in vitro and in vivo.

Los cuartetos de guanina (G4) del ADN son estructuras no canónicas formadas mediante el autorreconocimiento de cuatro guaninas en tétradas que se apilan entre sí. Los G4s son muy frecuentes en regiones reguladoras del genoma. En numerosos estudios, se ha relacionado la formación de G4s con procesos biológicos clave que abarcan desde el mantenimiento de los telómeros y la transcripción hasta la inestabilidad genómica y el cáncer. En concreto, el cáncer colorrectal (CRC) es el tercer tipo de cáncer más diagnosticado y constituye la segunda causa de muerte por cáncer en todo el mundo. Se requieren nuevas opciones de tratamiento para el CRC. Para simular la progresión del CRC, establecimos un modelo celular incluyendo la etapa no tumoral, de tumor primario y metastásica. A pesar de que las helicasas implicadas en desenrollar G4s se sobreexpresaron en CRC, la estabilización de los G4s y la inducción del daño en el ADN aumentaron a lo largo de la progresión del CRC tanto en la fase G0/G1 como S. Identificamos una asociación entre la presencia de G4s y la acumulación de roturas de doble cadena del DNA en su vecindad. El estado de plegamiento de los G4s desempeñó un papel en la expresión anormal de genes relevantes en CRC como CMYC. El G4 que se encuentra en su región promotora no estaba mutado. Varios ligandos de G4s conocidos provocaron citotoxicidad, careciendo de selectividad para células tumorales. Por una parte, examinamos la actividad antitumoral en CRC de varias diimidas de naftaleno (NDIs), un tipo de ligandos de G4s. Identificamos el compuesto T5 que inhibió de manera potente y selectiva el crecimiento celular tumoral mediante la unión a G4s presentes en el DNA ribosómico con gran afinidad, afectando así a la elongación por la RNA polimerasa I (Pol I). En consecuencia, T5 provocó una inhibición rápida de la transcripción por Pol I, desorganización del nucleolo, degradación vía proteasoma de la subunidad A catalítica de Pol I y autofagia. Asimismo, atribuimos una mayor selectividad de T5 para las células tumorales a que, al tratarse de un compuesto conjugado con carbohidrato, se captaría preferentemente por células tumorales que sobreexpresan el transportador de glucosa 1. Asimismo, demostramos sucintamente en una cohorte de pacientes con CRC que T5 podría ser explorado como agente terapéutico. Por otra parte, analizamos el potencial antitumoral en CRC de varios compuestos fenólicos naturales. Seleccionamos el ácido gálico (GA) como el mejor candidato en términos de potencia y selectividad. Demostramos el papel del GA como ligando de G4s, lo que explica varios de sus efectos antitumorales, incluida la inhibición transcripcional de los genes ribosomales y de CMYC. Además, el GA compartió varios efectos con otros ligandos de G4s conocidos como son la detención del ciclo celular, estrés nucleolar, inducción del daño en el DNA y de autofagia. Utilizando un modelo de xenógrafo de CRC, confirmamos que el GA poseía efecto antitumoral y estabilizador de G4s in vivo. También demostramos concisamente que el tratamiento con GA podría explotarse en una cohorte de pacientes con CRC. Finalmente, generamos una batería de nanoanticuerpos dirigidos a G4s mediante inmunización in vitro. Los nanoanticuerpos se producen a partir de anticuerpos de cadena pesada de camélidos por ingeniería genética. Aunque estos nanoanticuerpos presentaron reactividad cruzada con diferentes estructuras de G4, los nanoanticuerpos dirigidos específicamente al G4 de CMYC se enriquecieron a través de “biopanning” con disposición en fagos. En general, en la presente tesis doctoral, hemos analizado la implicación de los G4s en la carcinogénesis colorrectal y hemos investigado el potencial terapéutico de varios ligandos de G4s en CRC. Hemos desvelado un mecanismo de acción para los NDIs que involucra su acción sobre los G4s del DNA ribosómico y que el GA afecta la expresión génica interaccionando con G4s tanto in vitro como in vivo.