Genome Mining of the Strain Streptomyces sp. CA-170360: Identification and Heterologous Expression of Secondary Metabolite Biosynthetic Gene Clusters
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Román Hurtado, FernandoEditorial
Universidad de Granada
Departamento
Universidad de Granada. Programa de Doctorado en FarmaciaMateria
Genome minig Streptomyces sp. CA-170360 Análisis del genoma Streptomyces sp. CA-170360
Fecha
2022Fecha lectura
2022-06-10Referencia bibliográfica
Román Hurtado, Fernando. Genome Mining of the Strain Streptomyces sp. CA-170360: Identification and Heterologous Expression of Secondary Metabolite Biosynthetic Gene Clusters. Granada: Universidad de Granada, 2022. [http://hdl.handle.net/10481/75457]
Patrocinador
Tesis Univ. Granada.; IIMENA Challenge Grant de la Novo Nordisk FoundationResumen
The emergence of antibiotic resistant pathogenic strains, especially Gram-negative bacteria, has
seriously increased in the last decades, endangering the efficiency of the antibiotics used thus
far. As a result, the discovery of new molecules with potential antimicrobial activity has become
an essential matter. Historically, actinomycetes, particularly species from the genus
Streptomyces, have been one of the most prolific sources of novel antibiotics.
The strain Streptomyces cacaoi CA-170360 from the microbial collection of Fundación MEDINA
produces the novel cyclic pentapeptides pentaminomycins A-H, alongside the already known
cyclic pentapeptides BE-18257 antibiotics, with a moderate antibacterial activity against
Acinetobacter baumannii. This strain also produces cacaoidin, the first member of the new class
V lanthipeptides (or lanthidins) RiPP family, with bioactivity against Gram-positive pathogens,
such as Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Clostridium difficile. The genome
of this strain was sequenced and analyzed, and the biosynthetic gene clusters responsible of the
production of these compounds were identified, together with other biosynthetic gene clusters
involved in the production of different known secondary metabolites detected in the
fermentations of this strain.
Pentaminomycins A-H and BE-18257 antibiotics are two different families of cyclopeptides
synthesized by two independent non-ribosomal peptide synthetases encoded in tandem within
the same biosynthetic gene cluster (cpp). The cluster lacks a thiosterase domain to release and
cyclize the pentapeptides; however, it contains a stand-alone PBP-type protein with a betalactamase
conserved domain (CppA) upstream the first NRPS gene. The heterologous expression
of the cpp cluster in the host Streptomyces albidoflavus J1074 confirmed its implication in the
biosynthesis of both pentaminomycins and BE-18257 antibiotics, while the generation of a
knockout by genetic replacement of cppA demonstrated the involvement of this protein in the
release and cyclization of the peptide chains of both cyclopeptide families.
Cacaoidin is a novel glycosylated lanthipeptide with remarkable unprecedented structural
features, such as an unusually high number of D-amino acids, an N,N-dimethyl lanthionine system
(NMe2Lan), not previously found in known lanthipeptides, and an O-glycosylated Tyr residue with
a not previously reported disaccharide formed by α-L-rhamnose and β-L-6-deoxygulose. The
available predictive tools were not able to detect the biosynthetic gene cluster responsible of the
production of cacaoidin, which was found using the C-terminal amino acid sequence of the
structural peptide. The final cao cluster was determided after BLAST analysis and HHpred
secondary structure prediction. The heterologous expression of the cluster in S. albidoflavus
J1074 confirmed the involvement of the cluster in the biosynthesis of cacaoidin and led to the
identification of a new variant of cacaoidin with a different disaccharide lacking two oxygen
atoms (cacaoidin-2O). The generation of knockout strains in the heterologous host by genetic
replacement allowed the assignment of different roles in several genes in the biosynthesis of
cacaoidin: cao4 is involved in the N,N-dimethylation of the N-terminal Ala residue and cao8 and cao16 are two glycosyltransferases working cooperatively in the Tyr O-glycosylation. The
generation of the aglycon of cacaoidin was achieved by the controlled acid hydrolysis of pure
cacaoidin-2O. La aparición de cepas patógenas resistentes a antibióticos, especialmente bacterias Gramnegativas,
ha aumentado enormemente en los últimos años, comprometiendo la eficacia de los
antibióticos usados hasta el momento. Por ello, la búsqueda de nuevas moléculas con actividad
antimicrobiana se ha convertido en una tarea indispensable. Históricamente, los actinomicetos,
sobre todo las especies del género Streptomyces, han sido una de las grandes fuentes de nuevos
antibióticos.
La cepa Streptomyces cacaoi CA-170360, perteneciente a la colección microbiana de Fundación
MEDINA, produce una familia de nuevos ciclopentapéptidos, las pentaminomicinas A-H, junto
con los ya conocidos antibióticos BE-18257, también ciclopentapéptidos, con una moderada
actividad frente Acinetobacter baumannii. Esta cepa, además, produce cacaoidina, el primer
lantipéptido de clase V (lantidina) descrito, con actividad frente a patógenos Gram-positivos,
como Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) y Clostridium difficile. El genoma de
esta cepa fue secuenciado y analizado, llegando a identificar las rutas biosintéticas responsables
de la producción de ambas familias de compuestos, así como otras de rutas de biosíntesis de
metabolitos secundarios ya conocidos y detectados en las fermentaciones de la cepa.
Las pentaminomicinas A-H y los antibióticos BE-18257 son dos familias de ciclopentapéptidos
sintetizados por dos sintetasas de péptidos no ribosomales (NRPS) independientes pero
codificadas conjuntamente en la misma ruta biosintética (cpp). La ruta carece de un dominio
tioesterasa necesario para la ciclación y liberación de los pentapéptidos, pero contiene una
proteína aislada tipo PBP con un dominio beta-lactamasa conservado (CppA) aguas arriba de la
primera NRPS. La expresión heteróloga de la ruta cpp en el hospedador Streptomyces
albidoflavus J1074 confirmó que es la responsable de la biosíntesis tanto de las
pentaminomicinas A-H como de los antibióticos BE-18257, y la generación del mutante por
reemplazamiento génico del gen cppA demostró su implicación en la liberación y ciclación de
ambas familias de pentapéptidos.
La cacaoidina es un nuevo lantipéptido glicosilado con unas características estructurales no
descritas hasta el momento, como un número inusualmente elevado de D-aminoácidos, un anillo
de lantionina dimetilado (NMe2Lan), no encontrado en otros lantipéptidos, y una O-glicosilación
de un residuo de tirosina con un disacárido no descrito hasta la fecha en ningún otro producto
natural, formado por α-L-ramnosa y β-L-6-deoxigulosa. Las diferentes herramientas predictivas
disponibles no fueron capaces de identificar la ruta biosintética responsable de la producción de
cacaoidina, que se localizó usando la secuencia C-terminal de aminoácidos y encontrando el gen
estructural en el genoma. Finalmente, la ruta cao se delimitó mediante análisis BLAST y de
predicción de estructuras secundarias HHPred. Su expresión heteróloga en S. albidoflavus J1074
confirmó que es la ruta responsable de la producción de cacaoidina y llevó a la identificación de
una nueva variante de cacaoidina, glicosilada con un disacárido diferente que tiene dos átomos
menos de oxígeno (cacaoidina-2O). La generación de mutantes en el hospedador heterólogo nos permitió asignar las funciones de diferentes genes en la biosíntesis de cacaoidina: el gen cao4
participa en la doble metilación del residuo de Ala en el extremo amino-terminal, y los genes
cao8 y cao16 son dos glicosiltransferasas que trabajan de forma cooperativa en la glicosilación
del residuo de Tyr. Finalmente, la generación de aglicón se consiguió mediante la hidrólisis ácida
controlada de cacaoidina-2O.