Metabolismo de hemo en Leishmania major: caracterización de su biosíntesis a lo largo del ciclo de vida del parásito

Abstract

Una forma racional de buscar nuevos fármacos frente a las enfermedades parasitarias consiste en explotar las diferencias bioquímicas entre el parásito y el hospedador humano. Una de estas diferencias en los parásitos tripanosomátidos como Leishmania spp. y Trypanosoma spp. es su incapacidad de sintetizar hemo. La auxotrofía para hemo de los parásitos tripanosomátidos, y por lo tanto su absoluta dependencia para adquirirlo de una fuente exógena, ya fue considerada como su “Talón de Aquiles” hace más de 80 años. Esta auxotrofía se debe a que, a diferencia de lo que ocurre en la mayoría de los organismos aeróbicos, los parásitos tripanosomátidos han perdido completamente las enzimas de su ruta de síntesis durante la evolución de los kinetoplastidos. A diferencia de Trypanosoma spp., Leishmania spp. ha rescatado por transferencia horizontal desde γ-proteobacterias los genes que codifican para las tres últimas enzimas de la ruta de síntesis de hemo: coproporfirinógeno oxidasa (CPOX), protoporfirinógeno oxidasa (PPOX) y ferroquelatasa (FeCH). Ninguno de los genes que codifican para las primeras cinco proteínas de la ruta están presentes en los genomas de las diferentes especies de Leishmania secuenciadas hasta la fecha, y tampoco se ha detectado actividad enzimática relacionada con la producción de porfirinas. Por lo tanto, la presencia de los últimos tres genes es sorprendente y plantea preguntas acerca de su funcionalidad, puesto que Leishmania no puede producir porfirinas precursoras de la ruta de síntesis de hemo. Se ha sugerido que los amastigotes de Leishmania podrían tomar el precursor CPIII del citosol de la célula hospedadora para la formación de su propio hemo utilizando las últimas tres enzimas de la ruta, o que inclusive podrían hacer uso de ellas para reparar el hemo del macrófago parcialmente degradado o químicamente modificado en el ambiente ácido de la vacuola parasitófora. Por lo tanto, se ha propuesto que las proteínas involucradas con la síntesis de hemo de novo en Leishmania podrían constituir nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de la leishmaniasis. En este trabajo, utilizando diferentes inhibidores de la ruta de síntesis de hemo en los macrófagos, hemos demostrado que los amastigotes intracelulares son capaces de utilizar no solo hemo sintetizado por el macrófago sino también sus porfirinas precursoras, probablemente CPIII, para la síntesis de su propio hemo. Lo anterior demuestra la funcionalidad de la ruta parcial de síntesis de hemo en L. major. Para estudiar a profundidad el papel del hemo sintetizado por L. major a lo largo de su ciclo de vida, se evaluó la funcionalidad y la esencialidad de los genes que codifican para las tres últimas enzimas de la ruta presentes en este parásito: LmFeCH, LmPPOX y LmFeCH. Se demostró mediante ensayos de complementación funcional que los genes lmcpox, lmppox y lmfech codifican proteínas con actividad enzimática in vivo, puesto que su expresión heteróloga en cepas de bacterias y/o levaduras auxótrofas para hemo, fueron capaces de rescatar su crecimiento en ausencia de este metabolito. También se determinó la localización celular de las proteínas mediante marcaje in situ con una proteína fluorescente utilizando la estrategia CRISPR-Cas9. Mientras que en eucariotas superiores las tres enzimas son mitocondriales, sólo la LmFeCH de L. major se encuentra en la mitocondria de los parásitos mientras que LmCPOX es una proteína citosólica y la LmPPOX se localiza en estructuras subcelulares aun no identificadas cerca a la mitocondria. La obtención de parásitos mutantes nulos para los genes lmcpox, lmppox y lmfech mediante CRISPR-Cas9 indicó que estas proteínas no eran esenciales para L. major, al menos en el estadio extracelular cultivado in vitro. La infección artificial de flebótomos con parásitos mutantes nulos para FeCH, la última enzima de la ruta, demostró que la síntesis de hemo de novo no es esencial para el desarrollo de L. major en el insecto vector. Por otra parte, la replicación intracelular de estos mutantes en macrófagos cultivados in vitro fue significativamente menor en comparación con los parásitos control, sugiriendo la importancia de estas proteínas en el desarrollo del estadio amastigote de L. major. Sin embargo, los parásitos de L. major que carecían de los genes lmcpox, lmppox y lmfech produjeron enfermedad de manera similar a los parásitos control en un modelo murino de leishmaniasis cutánea. En conclusión, en el presente trabajo hemos demostrado que los amastigotes intracelulares y los promastigotes extracelulares de L. major pueden usar precursores de hemo, sintetizados por el macrófago o adicionados al medio de cultivo, para sintetizar su propio hemo. Sin embargo, esta actividad no es esencial para el desarrollo del ciclo de vida de L. major en el hospedero mamífero ni en el insecto vector, al menos bajo nuestras condiciones experimentales. Por lo tanto, las proteínas involucradas en la síntesis de hemo en Leishmania no representan dianas farmacológicas para el tratamiento de la leishmaniasis.