Aplicación de microorganismos promotores del crecimiento vegetal con actividad quorum quenching frente a estrés biótico y abiótico

Abstract

Se realizó un muestreo en el Saladar de El Margen (Granada), para conseguir aislar cepas que, además de tener la capacidad de resistir las condiciones climáticas adversas como la salinidad o la sequía, cumplan con estas dos características. En primer lugar, el muestreo en plantas, suelos y aguas del Saladar, un ambiente hipersalino y semiárido tuvo como resultado el aislamiento de 320 cepas en base a su morfología colonial. Estas junto con otras 71 cepas previamente aisladas por el grupo BIO 188 de ambientes salinos conformaron la colección de cepas de estudio de esta tesis doctoral. Tras un cribado inicial in vitro de características relacionadas con la promoción del crecimiento vegetal en 391 cepas, se seleccionaron 14 por su elevado potencial PGP que además demostraron una gran tolerancia a la salinidad. Los ensayos de promoción del crecimiento in vivo mostraron la capacidad de algunas de actuar positivamente sobre la germinación y el vigor de semillas de tomate, así como en el crecimiento y el desarrollo de la planta. Algunas exhibieron capacidad de interferir en los sistemas QS mediante una elevada versatilidad en la degradación enzimática de AHLs sintéticas. El análisis taxonómico permitió identificarlas como miembros de los géneros Bacillus, Cobetia, Paenibacillus, Peribacillus, Pseudoalteromonas, Pseudomonas, Psychrobacillus y Staphylococcus, siendo tres de ellas nuevas especies, Psychrobacillus vulpis Z8T (Rodríguez et al., 2019), Paenibacillus lutrae N10T (Rodríguez et al., 2019) y Peribacillus castrilensis N3T (artículo en preparación). En base a su potencial PGP y a su actividad QQ in vitro, se seleccionaron 3 cepas: Staphylococcus equorum EN21, Peribacillus castrilensis N3 y Pseudomonas segetis P6, todas ellas aisladas de la rizosfera de la planta halófila Salicornia hispánica. Se determinó la interacción planta-microorganismo a través del estudio de la movilidad, la quimiotaxis a ácido ɣ-aminobutírico (GABA) y exudados radiculares de plantas, así como la formación de biofilm y la producción de exopolisacáridos, todos ellos factores asociados a la colonización radicular de las plantas. Se demostró una movilidad de tipo swimming y swarming en la cepa P. castrilensis N3 y de tipo swimming, swarming y twitching en la cepa P. segetis P6. Todas mostraron atracción hacia los distintos compuestos y exudados de plantas ensayados, así como capacidad de formar biofilm en distintas condiciones de cultivo con o sin suplementación de exudados de plantas como inductores de la formación de estas biopelículas. Únicamente la cepa P. segetis P6 fue capaz de producir exopolisacárido. Estos resultados fueron confirmados mediante el 24 análisis de genes asociados con la movilidad, la quimiotaxis y la producción de exopolisacáridos. Un ensayo de colonización radicular in vitro en plantas de tomate finalmente confirmó que estas cepas realizan una colonización eficiente de la raíz de la planta. Mediante un primer ensayo in vivo en plantas de tomate se demostró un incremento en el peso de la parte aérea y radicular, así como un elevado desarrollo de su arquitectura radicular. Estos efectos positivos son consecuencia de varios factores: un claro impacto en el metabolismo del nitrógeno de las plantas asociado a un aumento de aminoácidos y proteínas la ausencia de estrés en la planta, a un incremento de la actividad de enzimas relacionadas con la fijación de CO2 y la asimilación de amonio, y al notable incremento de la concentración de ácido indolacético en las plantas tratadas con las tres cepas, todo ello sin causar estados de estrés en la planta. En relación con la actividad frente a fitopatógenos las tres cepas degradaron las AHL de Dickeya solani, Erwinia amylovora, Pectobacterium atrosepticum, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum y Pseudomonas syringae pv. tomato, lo que se tradujo en la interferencia de determinados rasgos fenotípicos que podrían afectar a su virulencia, como son la movilidad o la actividad enzimática. Se identificaron una enzima de tipo lactonasa en la cepa S. equorum EN21, dos enzimas de tipo acilasa en la cepa P. segetis P6 y una enzima de cada tipo en la cepa P. castrilensis N3, mostrando todas ellas homología con otras enzimas QQ previamente descritas. Estos hallazgos se confirmaron posteriormente por HPLC-MS y mediante el análisis genómico y estructural. En el caso de las acilasas de la cepa P. segetis P6 la actividad fue confirmada mediante una expresión heteróloga en E. coli DH5α. Los resultados de la inhibición de la virulencia en patatas, peras y zanahorias señalaron la capacidad de P. segetis P6 de inhibir completamente la virulencia de los fitopatógenos ensayados, Por el contrario, S. equorum EN21 y P. castrilensis N3 dieron lugar a un control parcial de la infección, salvo en el caso de esta última que inhibió totalmente la sintomatología producida por D. solani. Con respecto a los ensayos de interferencia en la patogenicidad de P. syringae pv. tomato en plantas de tomate, todas las cepas redujeron la incidencia y la severidad de la infección e incrementaron la biomasa y la clorofila. El análisis de metabolitos primarios y de compuestos redox, de la actividad enzimática y del perfil de fitohormonas, justificó estas propiedades. Por último, se analizó el papel de estas cepas en el crecimiento de las plantas bajo condiciones de estrés abiótico, en concreto, estrés hídrico y se observaron indicios de la capacidad de estas cepas para promover el crecimiento de las plantas de A. thaliana en condiciones de sequía al observar un incremento de la biomasa aérea y radicular con respecto a las plantas control. A la luz de nuestros resultados podemos afirmar que los ambientes salinos y áridos constituyen una fuente poco explorada de microrganismos con propiedades interesantes en la industria agrícola constituyendo una alternativa eficaz, segura y respetuosa al uso de fertilizantes y pesticidas químicos en los campos de cultivo.

Samples were taken from the Saladar de El Margen (Granada), to isolate strains which possess the ability to resist adverse climatic conditions such as salinity or drought, while meet these two characteristics. First, sampling in plants, soil and water from the Saladar, a hypersaline and semi-arid environment resulted in the isolation of 320 strains based on their colonial morphology. These, together with 71 strains previously isolated by the BIO 188 group from saline environments made up the collection of study strains of this doctoral thesis. After an initial in vitro screening of characteristics related with plant growth promotion in 391 strains, 14 were selected for their high PGP potential which also demonstrated a high tolerance to salinity. In vivo growth promotion assays showed the ability of some to act positively on the germination and vigour of tomato seeds, as well as in the growth and development of the plant. Some of them exhibited the ability to interfere with QS systems through high versatility of synthetic AHL enzymatic degradation. Taxonomic analysis allowed us to identify them as members of the genera Bacillus, Cobetia, Paenibacillus, Peribacillus, Pseudoalteromonas, Pseudomonas, Psychrobacillus and Staphylococcus, three of them constituting new species, Psychrobacillus vulpis Z8T (Rodríguez et al., 2019), Paenibacillus lutrae N10T (Rodríguez et al., 2019) and Peribacillus castrilensis N3T (article in preparation). Based on their in vitro PGP potential and QQ activity, 3 strains were selected: Staphylococcus equorum EN21, Peribacillus castrilensis N3 and Pseudomonas segetis P6, all of them isolated from the rhizosphere of the halophilic plant Salicornia hispanica. Plant-microorganism interaction was determined through the study of motility, chemotaxis to ɣaminobutyric acid (GABA) and root exudates, as well as the formation of biofilm and the production of exopolysaccharides, all factors associated with plant root colonization. Swimming and swarming motility was demonstrated in P. castrilensis N3 and swimming, swarming and twitching in the P. segetis P6. All showed attraction to the different compounds and plant root exudates tested, as well as the ability to form biofilm in different growing conditions with or without supplementation of plant exudates, as inducers of the formation of these biofilms. By contrast, only P. segetis P6 was able to produce exopolysaccharide. These results were confirmed by genome mining of genes associated with motility, chemotaxis, and exopolysaccharide production. An in vitro root colonization trial on tomato plants finally confirmed that these strains perform efficient colonization of the plant's root. A first in vivo test in tomato plants demonstrated an increase in the weight of the aerial and root part, as well as a high development of its root architecture. These positive effects are the result of several 26 factors: a clear impact on the nitrogen metabolism of plants related with an increase in amino acids and proteins, an increase in the activity of enzymes related to CO2 fixation and ammonium assimilation, and the notable increase in indoleacetic acid concentration in plants treated with these three strains, all this without causing states of stress in the plant. In relation to the activity against phytopathogens the three strains degraded Dickeya solani, Erwinia amylovora, Pectobacterium atrosepticum, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum and Pseudomonas syringae pv. tomato AHLs, which translates into the interference of certain phenotypic traits that could affect their virulence, such as motility or enzymatic activity. A lactonase-type enzyme was identified in S. equorum EN21, two acylase-type enzymes in P. segetis P6 and one enzyme of each type in P. castrilensis N3, all of which showed homology with other previously described QQ enzymes. These findings were subsequently confirmed by HPLC-MS and by genomic and structural analysis. In the case of acylases of P. segetis P6, the activity was confirmed by a heterologous expression in E. coli DH5α. Results from the interference of virulence assays in potatoes, pears and carrots indicated the ability of P. segetis P6 to completely inhibit the virulence of the tested phytopathogens. By contrast, S. equorum EN21 and P. castrilensis N3 resulted in a partial control of the infection, except for the last strain which totally inhibited the symptomatology produced by D. solani. Regarding the interference tests on P. syringae pv. tomato pathogenicity in tomato plants, all strains reduced the incidence and severity of infection and increased plant biomass and chlorophyll content. An analysis of primary metabolites and redox compounds, enzymatic activity and phytohormone profiling, justified these properties. Finally, the role of these strains on growth promotion under abiotic stress, in particular drought stress, was analysed and we detected clues of the ability of these strains to promote the growth of A. thaliana plants under drought conditions, what was associated with an increase in aerial and root biomass with respect to the control plants. Summarizing our results, we can affirm that saline and arid environments constitute an unexplored source of microorganisms with interesting properties for the agricultural industry constituting an effective, safe and eco-friendly alternative to the use of chemical fertilizers and pesticides in crop fields.