Análisis del genoma en pacientes con enfermedad de Ménière esporádica de inicio precoz

Abstract

Introducción: La enfermedad de Ménière (EM) es una enfermedad rara del oído interno caracterizada por ataques de vértigo asociados a pérdida de audición neurosensorial de bajas y medias frecuencias y acúfenos o sensación de plenitud ótica. Aunque su etiología permanece desconocida, su prevalencia varía de 0.5 a 1 por 1000 individuos, afectando en mayor medida a casos familiares (6-9%) que, a esporádicos, lo que sugiere una contribución genética. La EM es una enfermedad compleja, con una heterogeneidad genética que se ve acompañada de una gran diversidad en el fenotipo, lo que complica su diagnóstico. Objetivo: Identificar pacientes con EM de herencia recesiva, de inicio precoz, así como identificar nuevos genes que expliquen la heterogeneidad de la enfermedad. Así mismo, se identificará y caracterizará clínicamente la EM de inicio precoz no familiar, se realizará la secuenciación del genoma completo en tríos con caso índice de EM esporádica y se realizará un análisis integrado de datos genómicos para demostrar la acumulación de variantes raras en genes (homocigotas o heterocigotas compuestas). Métodos: En este estudio se incluirán un total de 6 tríos de pacientes españoles con EM esporádico con inicio precoz (≤ 35 años) que cumplan los criterios diagnósticos establecidos por el Comité de Audición y Equilibrio de la Sociedad Barany para EM definida. El ADN de los casos se extraerá a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) mediante la extracción de 12 ml de sangre venosa periférica. Tras la extracción, las muestras de ADN se conservarán a -20⁰C. Este estudio se llevará a cabo de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki de 1975 (revisada en 2013) para la experimentación humana. Los pacientes e individuos sanos serán informados sobre el estudio y se obtendrá su consentimiento informado verbal y escrito. Tras la extracción, el DNA de los pacientes se procesa para la preparación de librerías de genoma completo y posterior secuenciación A continuación, se realizará el variant calling, usando GATK, para realizar un realineamiento de los datos de secuenciación con el genoma de referencia humano GRCh37/hg19 y se generarán archivos Variant Call Format (VCF) con las variantes en cada sujeto incluyendo variantes de un solo nucleótido (SNV), inserciones /deleciones (INDELs), y variaciones de numero de copia (CNV) más su correspondiente anotación en las bases de datos de referencia de frecuencia poblacional (ExAC y gnomAD) y de caracterización clínica (ClinVar) incluyendo una predicción de patogenicidad a través de CADD (Combined Annotation Dependent Depletion). Con los resultados de cada trío se realizarán diversos tipos de análisis para cubrir las diversas hipótesis acerca de la aparición de EM precoz en los casos esporádicos (aparición de variantes de novo, herencia heterocigota compuestas y herencia homocigota). El análisis de agregación de variantes raras (MAF <0.05) en genes y redes de regulación génica se llevará a cabo de con las herramientas rvtest y GSEA. Las variantes noveles de interés serán validadas a través de secuenciación Sanger. Resultados: Para los cuatro primeros tríos se encontró una herencia autosómica recesiva, encontrándose variantes homocigotas con y sin cambio de sentido. Para los tríos cinco y seis se encontró una herencia dominante, con una variante heterocigota de novo en el trío cinco y una variante en el número de copia heterocigoto de novo en el trío seis. Conclusiones: Los pacientes con EM esporádica de inicio precoz tienen una mayor prevalencia de migraña que los pacientes de inicio tardío. Además, durante el análisis de citoquinas se encontró que la migraña no está asociada a ningún perfil de citoquinas en pacientes con EM. Los niveles de citoquinas en sangre varían entre pacientes con EM, migraña y controles, lo cual podría utilizarse como herramienta diagnóstica. La EM esporádica de inicio precoz podría explicarse mediante un modelo de herencia recesivo homocigoto. Este modelo de herencia para SNV con cambio de sentido se ha identificado para los genes SH3GL1 y LPCAT2, mientras que para SNV sin cambio de sentido se ha identificado para los genes RANBP9 y ASH2L.

Introduction: Meniere disease (MD) is a rare inner disease characterized by attacks of vertigo associated with low and medium frequency sensorineural hearing loss, and tinnitus or ear fullness. Although its etiology is unknown, its prevalence varies from 0.5 to 1 per 1000 individuals, affecting more familial cases (6-9%) than sporadic cases, which suggests a genetic contribution to MD. MD is a complex disease, with a genetic heterogeneity that is accompanied by a great diversity in the phenotype which complicates its diagnosis. Objective: To identify patients with early-onset recessive inheritance MD, as well as to identify new genes that could explain the heterogeneity of the disease. In addition, early-onset sporadic MD will be identified and clinically characterized. Whole genome sequencing will be performed in threesome in which the index will be a sporadic case of MD. Analysis of genomic data will be carried out to demonstrate accumulation of rare variants in genes (homozygous or compound heterozygous). Methods: This study will include a total of 6 threesome of Spanish patients with sporadic MD with early onset (≤35 years) according to the Barany Society’s Hearing and Balance Committee criteria. The DNA of the cases will be extracted from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) by extracting 12ml of venous blood. After the extraction, the DNA samples will be stored at -20ºC. This study will be carried out in accordance with the principles of the Helsinki Declarations of 1975 (revised in 2013) for human experimentation. Patients and controls will be informed about the study and their verbal and written consent will be required. Subsequently, the variant calling will be performed, using GATK for the realignment of the data with the GRCh27/hg19 human reference genome. Variant Call Format (VCF) files will be generated with the variants in each subject, including single nucleotide variants (SNV), insertions/deletions (INDELs), and copy number variations (CNV) and its corresponding annotation, in the population frequency reference databases (ExAC and gnomAD), and clinical characterization (ClinVar) including a pathogenicity prediction through CADD (Combined Annotation Dependent Depletion). With the results of each threesome, various type of analysis will be performed to cover the hypotheses about the appearance of early MD in sporadic cases (appearance of de novo variants, compound heterozygous inheritance, and homozygous inheritance). The gene rare variants aggregation analysis (MAF <0.05) and gene regulation networks will be carried out with the rvtest and GSEA tools. The novel variants of interest will be validated by Sanger sequencing. Results: For the first four threesome, an autosomal recessive inheritance was found, finding homozygous variants with and without change of sense. For the fifth and sixth threesome, dominant inheritance was identified, with one de novo heterozygous variant in the fifth threesome, and one de novo heterozygous copy number variant in the sixth one. Conclusions: Patients with early-onset sporadic MD have a higher prevalence of migraine than late-onset patients. Furthermore, cytokine analysis it was found revealed that migraine is not associated with any cytokine profile in MD patients. Cytokine levels in blood vary between patients with MD, migraine and controls. This could be used as a diagnostic tool. Early-onset sporadic MD could be explained by a homozygous recessive inheritance pattern. This inheritance model for missense SNV has been identified for SH3GL1 and LPCAT2 genes. Non-missense SNV has been identified for RANBP9 and ASH2L genes.