Evaluación de métodos moleculares para el diagnóstico de las infecciones de transmisión sexual y resistencia antibiótica de Mycoplasma genitalium

Abstract

En el primer capítulo se realizó una comparación entre técnicas basadas en PCR en tiempo real (RT-PCR) y Amplificación mediada por transcripción (TMA), para el diagnóstico de las ITS. Se analizaron un total de 622 muestras clínicas procedentes de diferentes localizaciones anatómicas utilizando ambos métodos. Se encontró un total de 88 (14,1%) y 66 (10,6%) muestras positivas para cualquiera de los ensayos TMA utilizados y para el ensayo RT-PCR, respectivamente. Los ensayos TMA mostraron una tasa ligeramente superior de resultados positivos para todos los patógenos, excepto para T vaginalis. El patógeno detectado con mayor frecuencia fue C. trachomatis (37 muestras; 5,9% con los ensayos TMA) y el lugar anatómico con mayor prevalencia de microorganismos fue un lugar no urogenital, la faringe (27 muestras positivas; 4,3%). Utilizando los ensayos TMA como método de referencia, la comparación mostró que la especificidad media de la RT-PCR multiplex era del 100% para los cuatro patógenos. Sin embargo, se observó una sensibilidad media del 74,5%, mostrando un 95,2% (CI95%; 93,6-96,9) de concordancia global (κ = 0,80) de la RT-PCR frente a las técnicas por TMA. En el segundo capítulo se evaluó el rendimiento clínico de un nuevo método de diagnóstico de ITS mediante el uso de microarrays (kit STD Direct Flow Chip), en dos etapas diferentes: (i) a partir de ADN purificado de trescientos cincuenta y ocho especímenes clínicos, con una sensibilidad y especificidad diagnósticas del 99,4% y el 100%, respectivamente, y una concordancia del 99% (índice kappa, κ = 0,97) con el método de referencia, y (ii) por PCR directa a partir de seiscientos treinta y tres especímenes, con valores de sensibilidad, especificidad y concordancia del 98,4%, 99,9% y 98,0% (κ = 0,95), respectivamente. En el tercer capítulo nos centramos en el estudio de las resistencias a antimicrobianos en M. genitalium (MG), del cual se desconocen las tasas de resistencias en nuestro medio. Para ello, se analizaron muestras positivas para MG recogidas entre junio de 2018 y junio de 2019 mediante la secuenciación de los genes 23S ARNr y parC. Se incluyeron un total de 77 pacientes (24 hombres que tienen sexo con hombres (HSH), 30 hombres heterosexuales y 23 mujeres), que mostraron mutaciones asociadas a la resistencia a macrólidos y fluoroquinolonas en el 36,4% (IC 95%: 25,7% a 48,1%) y el 9,1% (IC 95%: 3,7% a 17,8%) de los pacientes, respectivamente. Ser HSH y haber tenido otra ITS en el último año se asoció significativamente con la infección por MG resistente a los macrólidos, mientras que no se encontró ninguna asociación con la resistencia a las fluoroquinolonas.

In the first chapter, a comparison was made between tests based on real-time PCR (RT-PCR) and Transcription Mediated Amplification (TMA), for the diagnosis of STIs. A total of 622 clinical samples from different anatomical sites were analyzed using both methods. A total of 88 (14.1%) and 66 (10.6%) samples were found positive for either of the TMA assays used and for the RTPCR assay, respectively. The TMA assays showed a slightly higher rate of positive results for all pathogens, except for T. vaginalis. The most frequently detected pathogen was C. trachomatis (37 samples; 5.9% with TMA assays) and the anatomical site with the highest prevalence of microorganisms was a non-urogenital site, the pharynx (27 positive samples; 4.3%). Using the TMA assays as the reference method, the comparison showed that the mean specificity of multiplex RT-PCR was 100% for all four pathogens. However, a mean sensitivity of 74.5% was observed, showing 95.2% (CI95%; 93.6-96.9) overall agreement (κ = 0.80) of RT-PCR versus TMA techniques. The second chapter evaluated the clinical performance of a new STI diagnostic method using microarrays (STD Direct Flow Chip kit) in two different ways: (i) from purified DNA from three hundred and fifty-eight clinical specimens, with diagnostic sensitivity and specificity of 99.4% and 100%, respectively, and 99% concordance (kappa index, κ = 0.97) with the reference method, and (ii) by direct PCR from six hundred and thirty-three specimens, with sensitivity, specificity and concordance values of 98.4%, 99.9% and 98.0% (κ = 0.95), respectively. In the third chapter, we focused on the study of antimicrobial resistance in M. genitalium (MG), for which resistance rates in our environment are unknown. For this purpose, MG-positive samples collected between June 2018 and June 2019 were analyzed by 23S rRNA and parC gene sequencing. A total of 77 patients (24 men who have sex with men (MSM), 30 heterosexual men and 23 women) were included, showing mutations associated with macrolide and fluoroquinolone resistance in 36.4% (95% CI: 25.7% to 48.1%) and 9.1% (95% CI: 3.7% to 17.8%) of patients, respectively. Being MSM and having had another STI in the past year were significantly associated with macrolide-resistant MG infection, while no association was found with fluoroquinolone resistance.