Evolución y desarrollo del sistema apertural del polen en eudicotiledóneas basales: análisis del gen INAPERTURATE POLLEN1 e identificación de genes candidatos determinantes de la morfología apertural

Abstract

Esta tesis doctoral se desarrolla con el objetivo de estudiar la implicación de INP1 en la formación de aperturas en Eschscholzia californica, miembro de Papaveraceae. Por otro lado investigamos genes que posiblemente intervengan en la formación de las aperturas y en el determinismo de su forma. En el Capítulo 1 llevamos a cabo un estudio funcional de EcINP1 en Eschscholzia californica y proponemos genes candidatos a estar implicados en la formación de las aperturas. Analizamos la expresión temporal y espacial de EcINP1, validamos su función generando mutantes mediante silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) y comparamos la tasa de germinación y el transcriptoma de plantas salvajes con el de mutantes inp1. EcINP1 presenta su máxima expresión en anteras en estadio de desarrollo del polen de tétradas y su papel como un factor esencial para la 11 formación de las aperturas es conservado. En Eschscholzia californica las aperturas son prescindibles para la germinación del polen. Además, encontramos 971 genes diferencialmente expresados (DEGs) entre plantas salvajes y EcINP1-mutantes, entre los que destacamos los que son potenciales candidatos a intervenir en el proceso de formación de las aperturas, como los homólogos en E. californica de NUCLEOSOME ASSEMBLY PROTEIN 1 (NAP1), D6 PROTEIN KINASE LIKE 3 (D6PKL3) y PROTEIN KINASE ASSOCIATED WITH BRX (PAX). Estos genes mostraron patrones de expresión coincidentes con los de EcINP1, que apoyan su implicación en la formación de las aperturas y/o posible interacción de sus productos con la proteína EcINP1. En el Capítulo 2 identificamos genes que podrían estar implicados en el determinismo de la forma de las aperturas. Secuenciamos el transcriptoma de cuatro especies de Papaveraceae, de las que tres no está disponible su genoma de referencia, por lo que generamos un ensamblaje de referencia de novo para cada una de ellas. Filtramos y anotamos los ensamblajes de novo generados. Comparamos el transcriptoma de dos especies con polen colpado con el de otras dos con polen porado y analizamos los DEGs entre ambos grupos. Encontramos 531 DEGs entre los cuales no se encontraba el gen ELMOD_E, el único descrito hasta el momento como un posible factor determinante para la forma de las aperturas (Zhou et al., 2021), por tanto parece que ELMOD_E no regula el cambio de colpo a poro en Papaveraceae. En cambio INP1 si se encontraba diferencialmente expresado. Por otro lado, entre los DEGs encontramos genes implicados en procesos que posiblemente intervienen en la formación de las aperturas, como los relacionados con la síntesis o degradación de la calosa, destacando el factor de transcripción DYSFUNCTIONAL TAPETUM 1 (DYT1) o con la organización de elementos del citoesqueleto.

This doctoral thesis is developed with the aim of studying the involvement of INP1 in the formation of apertures in Eschscholzia californica, a member of Papaveraceae. On the other hand, we investigate genes that are possibly involved in the formation of the apertures and in the determinism of their shape. In Chapter 1 we perform a functional study of EcINP1 in Eschscholzia californica and propose candidate genes to be involved in the formation of the apertures. We analysed the temporal and spatial expression of EcINP1, validated its function by generating mutants through virus-induced gene silencing (VIGS) and compared the germination rate and transcriptome of wild-type plants with that of inp1 mutants. EcINP1 is maximally expressed in anthers at the tetrad stage of pollen development and its role as an essential factor for aperture formation is conserved. In Eschscholzia californica the apertures are dispensable for pollen germination. In addition, we found 971 differentially expressed genes (DEGs) between wild-type and 14 EcINP1-mutants, among which we highlight those that are potential candidates for involvement in the aperture formation process, such as the E. californica homologues of NUCLEOSOME ASSEMBLY PROTEIN 1 (NAP1), D6 PROTEIN KINASE LIKE 3 (D6PKL3) and PROTEIN KINASE ASSOCIATED WITH BRX (PAX). These genes showed expression patterns coincident with those of EcINP1, supporting their involvement in the formation of the apertures and/or possible interaction of their products with the EcINP1 protein. In Chapter 2 we identified genes that could be involved in aperture shape determinism. We sequenced the transcriptome of four species of Papaveraceae, three of which do not have their reference genome available, so we generated a de novo reference assembly for each of them. We filter and annotate the generated de novo assemblies. We compared the transcriptome of two species with colpate pollen with that of two others with porate pollen and analysed the differentially expressed genes between the two groups. We found 531 DEGs among which ELMOD_E, the only gene described so far as a possible determinant of aperture shape (Zhou et al., 2021), was not found, so ELMOD_E may not be regulating the change from colpo to pore in Papaveraceae. In contrast, INP1 was found to be differentially expressed. On the other hand, among the DEGs we found genes implicated in processes possibly involved in aperture formation, such as genes related to the synthesis or degradation of callose, including the transcription factor DYSFUNCTIONAL TAPETUM 1 (DYT1) or with the organisation of cytoskeletal elements.