Control of nucleotide homeostasis and genomic integrity in trypanosoma brucei: role of hd nucleotidases and base excision repair

Abstract

Trypanosoma brucei es un parásito protozoario de la clase Kinetoplástida, agente causal de la tripanosomiasis humana africana (HAT) o comúnmente conocida como la ―enfermedad del sueño‖. La transmisión está mediada por la picadura de la mosca tse-tsé (del género Glossina) y tanto parásito como vector se localizan mayoritariamente en el África subsahariana. Tras el desarrollo de numerosas iniciativas enfocadas al control de la enfermedad, el número de nuevos casos ha disminuido considerablemente, registrándose tan solo 977 casos en 2018 (WHO 2019). Sin embargo, a pesar de estos datos prometedores, los tratamientos disponibles siguen siendo escasos y muy tóxicos, y el desarrollo de resistencias constituye un inconveniente adicional (Buscher et al. 2017). Por esta razón, el descubrimiento de nuevos blancos de acción sigue siendo prioritario para mejorar la terapia contra la enfermedad. Por otra parte, T. brucei constituye un organismo modelo para el estudio de la biología de kinetoplástidos. La disponibilidad de sofisticadas herramientas de manipulación genética unido a la facilidad de cultivo y mantenimiento hacen de este organismo un paradigma para el estudio de la biología de organismos eucarióticos unicelulares. En todos los organismos la preservación de la integridad genómica es esencial, y en concreto, el correcto mantenimiento de los niveles de los nucleótidos (dNTPs) posee un papel primordial. De hecho, desequilibrios en el ―pool‖ de dNTPs da lugar a procesos que comprometen gravemente la viabilidad celular, como genotoxicidad, mutagénesis o tumorogénesis (Kohnken et al. 2015). De esta manera, los componentes del metabolismo de nucleótidos pueden suponer una fuente importante de dianas terapéuticas. Los dNTPs pueden ser sintetizados en la mayoría de organismos por dos rutas metabólicas, la vía de recuperación de nucleósidos pre-formados y la síntesis de novo (Wang 2016). Mientras que T. brucei carece de las enzimas necesarias para sintetizar purinas de novo, es capaz de sintetizar los nucleótidos de pirimidina por ambas vías. A pesar de esta aparente redundancia metabólica para la generación de precursores pirimidínicos, ciertas enzimas implicadas en la biosíntesis del timidilato, como la dihidrofolato reductasa-timidilato sintasa (DHFR-TS), timidina kinasa (TK), desoxiuridina trifosfato hidrolasa (dUTPasa) o la citidina desaminasa (CDA), han demostrado ser esenciales para la viabilidad del parásito (Sienkiewicz et al. 2008; Castillo-Acosta et al. 2013; Leija et al. 2016; Valente et al. 2016). En concreto, líneas de T. brucei deficientes en TK no son viables y acumulan nucleósidos intracelulares tanto en ausencia como en presencia de un aporte exógeno de nucleósidos. Por otra parte, se ha demostrado que la fosforilación de la desoxiuridina (procedente de la desaminación de la desoxicitidina) via TK es un paso esencial en la síntesis de timidilato. Estas observaciones plantean la hipótesis de que T. brucei expresa nucleotidasas implicadas en la formación de nucleósidos intracelulares esenciales para la síntesis de timidilato. Por esta razón, el objetivo principal de esta tesis fue la identificación de dNTPasas en T. brucei que pudieran estar implicadas en este proceso.

The first aim of this research was the identification of HsSAMHD1 orthologues in T. brucei, as well as the evaluation of their role in cell viability and homeostasis of pyrimidine dNTPs. To this purpose, the following specific objectives were proposed: 1. Identify potential HsSAMHD1 orthologues in T. brucei with a predicted dNTPase activity and determine their intracellular localization. 2. Evaluate the role of HsSAMHD1 orthologues in cell viability and cell cycle progression. 3. Establish the role of the identified dNTPases in the supply of pyrimidine and purine nucleosides. 4. Analyze the contribution of dNTPases to pyrimidine and thymidylate biosynthesis. 5. Determine the impact of perturbations in dNTP hydrolysis on genomic integrity. DNA lesions can derive from polymerase action during replication or external agents that modify DNA bases, which can lead to severe damage, such as mutations, DNA breaks or AP sites. In the case of T. brucei, during infection parasites are especially exposed to an intense oxidative stress as a result of the response of the immune system. In order to counteract this situation and sustain genomic integrity, cells trigger multiple repair mechanisms. Previous studies conducted in the lab have already demonstrated the importance of UNG for T. brucei infectivity, as UNG-deficient parasites showed reduced virulence. Thus, a second general aim of this thesis was to analyze the occurrence of oxidative stress and the activation of DNA repair pathways during host-pathogen interactions in vivo. The following specific objectives were proposed: 1. Evaluate the impact of oxidative stress on DNA integrity in T. brucei BSFs exposed to genotoxic compounds in vitro. 2. Analyze the consequences on parasites of the potential oxidative stress that arises upon murine infection and the activation of a DNA damage response. 3. Determine the relevance of UNG and the BER pathway in counteracting DNA damage produced by oxidative stress.