Interacción del óxido nítrico (NO) y antioxidantes en el fruto de pimiento (Capsicum annuum L.): estudio transcriptómico, proteómico y funcional

Abstract

La maduración es un proceso fisiológico complejo, altamente coordinado que implica la sincronización de diferentes sucesos metabólicos que, junto a las alteraciones producidas durante la post-cosecha, van a determinar las propiedades organolépticas y la calidad nutricional de los frutos. Entre los numerosos cambios bioquímicos que se producen durante el desarrollo de los frutos cabe destacar aquellos asociados al metabolismo oxidativo y nitrosativo, donde moléculas como las especies de oxígeno y nitrógeno reactivo (ROS y RNS, respectivamente) y los sistemas antioxidantes pueden interaccionar, llegando a desempeñar funciones fundamentales. A pesar de su gran importancia agronómica, los estudios genéticos y transcriptómicos sobre los diferentes mecanismos de regulación que orquestan el desarrollo y la maduración del fruto de pimiento (Capsicum annuum L.) son bastante limitados, fundamentalmente, por la ausencia de recursos genómicos en esta especie. Por ello, uno de los principales objetivos perseguidos en esta Tesis Doctoral fue la construcción, mediante un ensamblaje de novo, del transcriptoma del fruto de pimiento dulce tipo California, de gran importancia en el sureste de España, lo que nos ha permitido obtener una visión global, a nivel de expresión génica, de los diferentes aspectos metabólicos implicados en el proceso de maduración. Asimismo, se ha analizado la expresión de diferentes familias génicas íntimamente vinculadas con el metabolismo oxidativo como las NADPH oxidasas (NOX) y las superóxido dismutasas (SODs), encargadas de la producción y eliminación de radicales superóxido (O2•‒), respectivamente. Dicho análisis se ha complementado con el estudio de otros sistemas enzimáticos encargados de la destoxificación de H2O2 como la catalasa (CAT), las peroxidasas (POXs), las peroxirredoxinas (Prxs) y las enzimas del ciclo ascorbatoglutatión (AsA-GSH). En general, se observaron perfiles de expresión heterogéneos, lo que sumado a la falta de correlación con sus respectivos análisis funcionales, parece indicar la existencia de mecanismos de regulación complejos, donde las modificaciones post-traduccionales (PTMs) propiciadas por ROS y RNS podrían ser claves en la maduración de los frutos de pimiento. Del mismo modo, el análisis proteómico llevado a cabo en esta Tesis Doctoral ha posibilitado el establecimiento de patrones diferenciales en la abundancia relativa de proteínas entre los frutos verdes y rojos de pimiento. Adicionalmente, a partir de diferentes aproximaciones in silico, se llevó a cabo una clasificación de las diferentes proteínas identificadas atendiendo a su localización subcelular. Entre todas ellas, se prestó especial atención a las proteínas mitocondriales y peroxisomales lo que, además de corroborar la importancia de estos orgánulos en el proceso de maduración del fruto de pimiento, ha supuesto una mejora sustancial frente a los resultados que se habían obtenido previamente empleando diferentes aproximaciones metodológicas que implicaban el aislamiento de dichos orgánulos. El óxido nítrico (NO) es una molécula gaseosa implicada en la regulación de numerosos procesos fisiológicos en plantas, entre los que se encuentra la maduración. La integración de los análisis transcriptómico, proteómico y funcional de frutos de pimiento sometidos a una atmósfera enriquecida en NO, nos ha permitido profundizar en cómo esta molécula es capaz de modular dicho proceso. Esta información cobra especial relevancia al tratarse de un fruto no climatérico, ya que el NO opera en los frutos climatéricos de una forma totalmente opuesta a como lo hace el etileno (ET). Todo el abordaje realizado en esta Tesis Doctoral ha generado ciertos modelos fisiológicos, hasta ahora no descritos en frutos, lo que ha posibilitado el establecimiento de nuevas líneas de investigación orientadas a posibles aplicaciones biotecnológicas en el sector agroalimentario, no solo para el cultivo de pimiento sino también de otros productos hortícolas.

Ripening is a complex, highly coordinated physiological process that involves the synchronization of different metabolic processes which, in combination with post-harvest alterations, determine the organoleptic properties and nutritional quality of the fruit. Among the multiple biochemical changes that occur during fruit development, it is important to highlight those associated with oxidative and nitrosative metabolism, involving molecules such as reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS, respectively) and antioxidant systems, which can interact and play fundamental roles. Despite its agronomic relevance, genetic and transcriptomic studies on the regulatory mechanisms that orchestrate pepper (Capsicum annuum L.) fruit development and ripening have been limited due to the lack of genomic resources in this species. Therefore, one of the main goals of this PhD Thesis was to accomplish a de novo assembly of the transcriptome from California-type sweet pepper fruit what has allowed us obtaining an overview, at the gene expression level, of the different metabolic processes involved in the ripening process. Likewise, the expression of different gene families related to oxidative metabolism such as NADPH oxidases (NOX) and superoxide dismutases (SODs), which are responsible for the production and scavenging of superoxide radicals (O2•‒), respectively, was analyzed. Other enzyme systems involved in H2O2 detoxification such as catalase (CAT), peroxidases (POXs), peroxiredoxins (Prxs) and ascorbate-glutathione cycle enzymes (AsA-GSH) were also studied. Overall, heterogeneous expression profiles were observed, a fact that, in addition to the lack of correlation with their respective functional analyses, suggests the existence of complex regulatory mechanisms, in which post-translational modifications (PTMs) triggered by ROS and RNS could play a key role in pepper fruit ripening. Likewise, the proteomic analysis performed in this PhD Thesis enabled the establishment of differential patterns in the relative abundance of proteins between green and red pepper fruits. Additionally, using different in silico approaches, we were able to classify the identified proteins according to their subcellular localization. Among them, we paid special attention to the mitochondrial and peroxisomal proteins, corroborating the importance of these organelles in the ripening process of pepper fruit, and providing a substantial improvement comparing to previous results obtained using different methodological approaches which involved the isolation of these organelles. Nitric oxide (NO) is a gaseous molecule participating in the regulation of numerous physiological processes in plants, including ripening. The integration of transcriptomic, proteomic and functional analyses of pepper fruits subjected to a NOenriched atmosphere provided better insights into how this molecule can modulate this process. This information is especially relevant in the case of non-climacteric fruits since NO operates in climacteric fruits in an opposite way to ethylene. The whole approach carried out in this PhD Thesis has generated several physiological models, not described in fruits so far, opening new lines of researchoriented to possible biotechnological applications in the agri-food sector, not only for the cultivation of peppers but also for other horticultural products.