Identificación de nuevos biomarcadores para cáncer colorrectal metastásico: análisis genómico y metabólomico

Abstract

El cáncer colorrectal (CCR) debe ser considerado como un auténtico problema de salud pública tanto por su incidencia, es el tercer tumor más frecuente en el mundo representando el 10 % del total de las neoplasias, como por su mortalidad que lo sitúa como la segunda causa de muerte por cáncer. En España y considerando ambos sexos, el CCR es el más tumor más frecuente superando en la actualidad al de mama y pulmón. A pesar de los importantes avances en el tratamiento del CCR en los últimos años y de la mejora en su diagnóstico precoz, un número muy importante de pacientes, entre un 20-25%, presentan enfermedad metastásica en el momento del diagnóstico y hasta un 50% desarrollan metástasis a lo largo de la evolución de la enfermedad. Por tanto, el diagnóstico precoz, así como el desarrollo de estrategias para determinar su pronóstico y la eficacia de la terapia aplicada, es un campo prioritario en la investigación oncológica. En este contexto, el conocimiento cada vez más profundo de la etiopatogenia del CCR, el carácter heterogéneo del mismo, y la demostración de que múltiples alteraciones tanto genéticas como epigenéticas son capaces de alterar los mecanismos de control de los procesos de proliferación , diferenciación y apoptosis celular, están dando paso, no sólo al uso de nuevas dianas moleculares que permitan un tratamiento más preciso y específico, sino a la determinación de nuevas biomoléculas, que usadas como biomarcadores, puedan indicarnos la presencia, la evolución y/o la respuesta al tratamiento de la enfermedad. Los biomarcadores tumorales, entendidos como entidades biológicas que puede ser detectadas en los diferentes medios orgánicos de pacientes con cáncer, son las moléculas que están permitiendo el seguimiento de la enfermedad monitorizando sus niveles, su diagnóstico (incluyendo métodos de screening poblacional), su pronóstico e incluso, el seguimiento de la respuesta terapéutica. En la actualidad, existe un déficit de marcadores precisos y sensibles para el cáncer en general y para el CCR en particular. Así, son muchos los estudios que han investigado como biomarcador en CCR, moléculas de DNA liberadas a sangre en procesos de apoptosis celular o paso de células vivas al torrente circulatorio (CTSs). Los exosomas, pequeñas vesículas envueltas por una bicapa lípidica que están implicados en la transferencia de miRNAs, ARMm y proteínas a una célula diana, también han sido propuestos como biomarcadores de esta enfermedad. Incluso la presencia en el suero de pacientes con CCR de determinadas proteínas ha sido analizada ampliamente, a pesar de lo cual, sólo CEA y CA-19-9 siguen siendo clínicamente utilizadas, aunque adolecen de una baja sensibilidad y especificidad. Múltiples estudios han sido también realizados para determinar miRNA en pacientes con CCR que sean específicos para su diagnóstico o pronóstico, pero sin resultados definitivos. Entre las moléculas más ampliamente analizadas como biomarcadores de CCR se encuentran la presencia de ARNm en sangre periférica. En este contexto, el ARNm de moléculas relacionas con el proceso de la angiogénesis han cobrado un gran interés en el CCR, habiéndose testado la sobreexpresión de moléculas como PTGS2 y GUCY2C como marcadores de la enfermedad o de la presencia de metástasis ocultas en pacientes con CCR. Por otra parte, la metabolómica, una disciplina que evalúa los metabolitos endógenos producidos por el organismo, esta revolucionado el campo de los biomarcadores para distintos tipos de patologías. Aplicada al cáncer, la metabolómica ofrece una representación molecular del fenotipo tumoral que puede servir para el diagnóstico, el pronóstico y la identificación de subgrupos relevantes desde un punto de vista clínico. Las células tumorales adaptan su metabolismo a una proliferación descontrolada que provoca alteraciones metabólicas que tiene su reflejo en la aparición o la modulación de los niveles de metabolitos. En el CCR, algunos metabolitos concretos (ácido betahidroxibutirato, cistamina, ácido aspártico, entre otros) han sido propuestos para el diagnóstico de CCR tanto en sangre como en orina, aunque la complejidad para detectarlos y su elevado coste hace necesarios más esfuerzos de investigación para llevarlos a la práctica clínica. En este contexto, nuestro trabajo ha tenido dos objetivos fundamentales: i) Por una parte, realizar un estudio de la utilidad de genes intensamente relacionados con el proceso de angiogénesis, fenómeno esencial en el crecimiento y la expansión metastásica de un tumor, como nuevos biomarcadores de fácil detección en sangre períferica o en suero de los pacientes con CCRm. Para ello hemos seleccionado cinco genes, GUCY2C, JAG1, PTGS2, PGF y MMP7, con demostrada relevancia en la angiogénesis y hemos determinado los niveles de ARN circulante tanto en suero como en células mononucleares de sangre periférica en un grupo de 59 pacientes con CCRm enfrentados a un grupo de 47 controles sanos. La presencia de estos marcadores en los fluidos biológicos fue realizada por una tecnología altamente sensible como es la dPCR que permitiría un fácil desarrollo de su aplicación clínica en un corto plazo de tiempo, mientras que el análisis del AUC se utilizó para estimar el valor predictivo de los biomarcadores tanto de forma individual como en combinaciones (firma biológica). ii) Por otra parte, hemos realizado un estudio para identificar biomarcadores basados en la determinación de metabolitos en suero de pacientes de CCRm que sea útil en el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de estos pacientes. En este caso y basándonos en técnicas de metabolómica no dirigida, se han analizado los sueros de un grupo 65 pacientes con CCRm enfrentados a 60 controles sanos. Las muestras fueron sometidas a estudios mediante cromatografía líquida de fase inversa acoplada a espectrometría de masas de alta resolución (LC-HRMS), que nos permitió obtener una matriz para comparar controles sanos con pacientes con CCR. Los metabolitos obtenidos fuero analizados de forma individual y también en forma de “clúster” con el objeto de obtener una posible huella biológica.

Colorectal cancer (CRC) must be considered a real public health problem both because of its incidence, it is the third most frequent tumour in the world, representing 10% of all neoplasms, and because of its mortality, which places it as the second leading cause of death from cancer. In Spain and considering both sexes, CRC is the most frequent tumour, currently surpassing breast and lung tumours. Despite the important advances in the treatment of CRC in recent years and the improvement in its early diagnosis, a very important number of patients, between 20- 25%, present metastatic disease at the time of diagnosis and up to 50 % develop metastases throughout the course of the disease. Therefore, the determination of the metastatic stage of the disease at an early stage, as well as the development of strategies to determine its prognosis and the effectiveness of the applied therapy, is a priority field in cancer research. In this context, the increasingly in-depth knowledge of the etiopathogenesis of CRC, its heterogeneous nature, and the demonstration that multiple genetic and epigenetic alterations are capable of altering the control mechanisms of proliferation, differentiation and apoptosis cellular, are giving way, not only to the use of new molecular targets that allow a more precise and specific treatment, but to the determination of new biomolecules, which, used as biomarkers, can indicate the presence, evolution and / or response to treatment of the illness. Tumour biomarkers, understood as biological entities that can be detected in the different organic environments of cancer patients, are the molecules that are allowing the follow-up of the disease by monitoring its levels, its diagnosis (including population screening methods), its prognosis and even the follow-up of the therapeutic response. At present, there is a shortage of precise and sensitive markers for cancer in general and for CRC in particular. Thus, there are many studies that have investigated as a biomarker in CRC, DNA molecules released into the blood in process of cellular apoptosis or passage of living cells into the circulatory stream (circulating tumor cells or CTSs). Exosomes, small vesicles surrounded by a lipid bilayer that are involved in the transfer of miRNAs, mRNAs and proteins to a target cell, have also been proposed as biomarkers of this disease. Even the presence in the serum of patients with CRC of certain proteins has been extensively analyzed, despite which, only CEA and CA-19-9 are still used clinically, although they suffer from low sensitivity and specificity. Multiple studies have also been carried out to determine microRNA in patients with CRC that are specific for their diagnosis or prognosis but without definitive results. Among the molecules most widely analysed as CRC biomarkers are the presence of messenger RNA (mRNA) in peripheral blood. In this context, the mRNA of molecules related to the angiogenesis process have gained great interest in CRC, having tested the overexpression of molecules such as PTGS2 and GUCY2C as markers of the disease or of the presence of hidden metastases in patients with CRC. On the other hand, metabolomics, a discipline that evaluates the endogenous metabolites produced by the body, has revolutionised the field of biomarkers for different types of pathologies. Applied to cancer, metabolomics offers a molecular representation of the tumour phenotype that can be used for diagnosis, prognosis, and identification of clinically relevant subgroups. Tumour cells adapt their metabolism to uncontrolled proliferation that causes metabolic alterations that are reflected in the appearance or modulation of metabolite levels. In CRC, some specific metabolites (beta-hydroxybutyrate acid, cystamine, aspartic acid, among others) have been proposed for the diagnosis of CRC in both blood and urine, although the complexity to detect them and their high cost require more research efforts to take them into clinical practice. In this context, our work has had two fundamental objectives: i) On the one hand, to carry out a study that the utility of genes intensely related by the angiogenesis process, an essential phenomenon in the growth and metastatic expansion of a tumor, as new biomarkers easily detected in peripheral blood or serum of patients with metastatic CRC. For this we have selected five genes, GUCY2C, JAG1, PTGS2, PGF and MMP7, with demonstrated relevance in angiogenesis and we have determined the levels of circulating RNA both in serum and in peripheral blood mononuclear cells in a group of 59 patients with metastatic RCC faced with a group of 47 healthy controls. The presence of these markers in biological fluids was carried out by a highly sensitive technology such as digital PCR (dPCR) that would allow an easy development of its clinical application in a short period of time, whilst the analysis of the area under the curve (AUC) was used to estimate the predictive value of biomarkers both individually and in combinations (biological signature). ii) On the other hand, we have carried out a study to identify biomarkers based on the determination of metabolites in the serum of metastatic CRC patients that is useful in the diagnosis, prognosis and follow-up of these patients. In this case, and based on undirected metabolomics techniques, the sera of a group of 65 patients with metastatic CRC compared to 60 healthy controls were analysed. The samples were subjected to studies by reverse phase liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry (LC-HRMS), which allowed us to obtain a matrix to compare healthy controls with patients with CRC. The metabolites obtained were analyzed individually and also in the form of a "cluster" in order to obtain a possible biological trace.