Adaptación de rizobios y bacterias solubilizadoras de fosfato a condiciones salino-alcalinas para el desarrollo de biofertilizantes eficientes para Lotus tenuis e identificación de genes bacterianos implicados en la tolerancia a dicha condición

Abstract

La región de la Pampa Deprimida del Salado (PDS) concentra la mitad del stock de bovino de la provincia de Buenos Aires y se considera la región de cría más importante de la Argentina. No obstante, aproximadamente el 60% de superficie de esta región está dominada por “suelos bajos” cuyas características edáficas limitan severamente la producción de pasturas de calidad. En ese contexto, hay un profundo interés por la búsqueda de alternativas que posibiliten un mejor aprovechamiento de estos suelos bajos, con el objetivo de incrementar el recurso forrajero y subsecuentemente, la productividad ganadera. Entre las estrategias propuestas, el uso de leguminosas nativas o naturalizadas como Lotus tenuis es una de las más destacadas. Esta leguminosa es muy atractiva por su altísimo valor forrajero y por su adaptación a los diferentes ambientes de la PDS, incluso a aquellos que representan las zonas más restrictivas como los bajos alcalino-sódicos. No obstante, la incorporación exitosa a estos últimos está todavía lejos de ser óptima. En respuesta a esta problemática, en este trabajo de tesis se propuso la búsqueda de bacterias promotoras de crecimiento vegetal asociadas a L. tenuis, tolerantes a condiciones salino-alcalinas, para el diseño de bio-formulados como estrategia de mejora para la producción de pasturas en la Pampa Deprimida del Salado. Para ello, como tema central, se analizaron dos comunidades de bacterias: bacterias solubilizadoras de fosfato (BSF) y bacterias fijadoras de nitrógeno (BFN). Se analizó una población de 310 bacterias solubilizadoras de fosfato aisladas de la rizosfera de plantas de L. tenuis naturalizadas en los suelos bajos alcalino-sódicos de la Pampa Deprimida del Salado, de la cual más del 95% mostró la capacidad de solubilizar fosfato bajo condiciones salino-alcalinas. De acuerdo a ello, los aislamientos se cualificaron en 3 grupos fenotípicos, siendo el grupo de bacterias con capacidad solubilizadora de fosfato de rango amplio (BSFRA) el más promisorio, por su plasticidad para solubilizar fosfato en diferentes condiciones alcalino-sódicas. Este grupo resultó ser muy diverso genéticamente, además de estar compuesto exclusivamente por miembros de la familia Pseudomonadaceae y del orden Enterobacteriales (este último el más dominante), pertenecientes a al menos 7 géneros bacterianos. El género Pantoea fue uno de los más abundante con 9 cepas genéticamente diferentes. En base a sus antecedentes en la promoción del crecimiento vegetal y al criterio de “uso de microorganismos seguros” se selecionaron las cepas de P. eucalypti MA66, P76, P63, P163 y P173 para estudios comparativos tanto in vitro como en planta. Todas las cepas de P. eucalypti mostraron atributos PGPR in vitro evidenciando su potencial efecto promotor en plantas. No obstante, cuando fueron evaluadas en el sistema tripartito Rizobio-PGPR-leguminosa en suelos alcalino-sódicos, mostraron efectos diferenciales notables en las variables de crecimiento peso seco total, peso seco de vástago y peso seco de nódulos, así como en la concentración y acumulación de P, N y Zn. Estos resultados revelaron la fuerte variabilidad intra-especie y la complejidad de las interacciones planta-microorganismo, además de la importancia de la evaluación in planta para la selección de cepas promisorias para la elaboración de bioformulados. Simultáneamente se realizó otro análisis de prospección de la comunidad de rizobios simbiontes asociados a L. tenuis. Con ese fin se analizó una comunidad de 126 rizobios infectivos que reveló ser genéticamente muy diversa, además de estar dominada –aunque no exclusivamentepor miembros del género Mesorhizobium; otros miembros de la familia Phyllobacteriaceae (Aminobacter y Phyllobacterium) también fueron identificados. Mediante la caracterización de la tolerancia a condiciones salinas y/o alcalinas, se determinó que la comunidad de simbiontes infectivos es mayoritariamente sensible a estas condiciones in vitro. El mismo patrón de comportamiento se observó en un sistema in vivo con suelo proveniente de los bajos alcalino-sódicos, aunque este último no fue tan restrictivo como el primero. La comparación de los resultados obtenidos en ambos sistemas evidenció la complejidad de los mecanismos de adaptación de los rizobios frente al estrés abiótico del medio. De toda la comunidad de rizobios infectivos se identificó a las cepas del género Aminobacter como las más destacadas en cuanto a sus capacidades de adaptación a las condiciones salino-alcalinas in vitro y en suelo. En base a estos resultados, se utilizó un rizobio del género Aminobacter tolerante a condiciones alcalino-sódicas para profundizar el conocimiento acerca de sus mecanismos de tolerancia. Se seleccionó a la cepa Aminobacter sp. BA135 como organismo de estudio para la identificación de los mecanismos de tolerancia a las condiciones salino-alcalinas. Mediante mutagénesis aleatoria se identificaron dos grupos de genes involucrados en la respuesta a salinidad o a salinidad y alcalinidad en simultáneo. Mientras que entre las estrategias de respuesta a salinidad se hallaron la modificación de la estructura de la pared bacteriana, el uso de osmolitos compatibles y el control del estrés oxidativo, frente al estrés salino-alcalino, se identificó como principal estrategia de respuesta la regulación de la homeostasis, seguido de la modulación del metabolismo de pared bacteriana también y la activación de genes de respuesta al estrés. Además, se identificó la cobalamina (vitamina B12) como molécula importante para la tolerancia a estrés alcalino-salino. De manera complementaria, un estudio transcriptómico abundó en el hecho de que BA135 emplea una variedad de estrategias complejas y coordinadas con el fin de mantener las funciones centrales y asegurar la viabilidad celular, que incluyen la regulación de la homeostasis, almacenamiento de fuentes de carbono, control de los niveles de especies reactivas al oxígeno (ROS), cambios de expresión en los sistemas de transporte de sustratos, optimización de los recursos energéticos, expresión de genes de respuesta al estrés y la acumulación de osmoprotectores. Este estudio reveló también una interesante conexión entre la síntesis de metionina dependiente de cobalamina y el metabolismo del soluto compatible glicina-betaína en condiciones de estrés. Los resultados de esta tesis ponen de manifiesto la composición de las comunidades de BSF y BFN asociadas a L. tenuis y su potencial para promover el crecimiento y la nutrición mineral en L. tenuis cuando se utilizan consorcios compatibles, así como los múltiples mecanismos de tolerancia frente al estrés salino-alcalino por parte del rizobio Aminobacter sp. BA135, que pueden aportar a mejorar la sobrevida de los microorganismos formulados en los bioinsumos en ambientes restrictivos como los bajos alcalinos-sódicos.

The Flooding Pampa region contains half of the total cattle stock in the province of Buenos Aires and is considered the most important breeding region in Argentina. However, approximately 60% of its surface is dominated by “lowlands” whose edaphic characteristics severely limit the production of quality pastures. In this context, there is a deep interest in the search for alternatives that allow the use of these lowlands in order to improve the forage resource as well as the livestock productivity. Among the strategies that have been proposed, the use of native or naturalized legumes, such as Lotus tenuis, is one of the most outstanding. This legume is very attractive because of its high forage value and adaptation to the different Flooding Pampa environments, even those that represent the most restrictive zones such as the alkaline-sodic lowlands. However, the successful incorporation into the latter is still far from optimal. In response to this problem, this thesis proposes the search for growthpromoting bacteria associated with L. tenuis, tolerant to saline-alkaline conditions, for the design of bio-formulates as a strategy to improve pasture production in the alkaline-sodic lowlands of Flooding Pampa. For this purpose, two bacterial communities were analyzed: Phosphate solubilizing bacteria (PSB) and nitrogen fixing bacteria (NFB). A total of 310 phosphate solubilizing bacteria isolated from the rhizosphere of L. tenuis plants naturalized from the soils of the alkaline-sodic lowlands was analyzed, of which more than 95% showed the ability to solubilize phosphate under saline-alkaline conditions. According to this, the isolates were qualified in 3 phenotypic groups, with the group of bacteria with broad range phosphate solubilizing ability (BSFRA) being the most promising one due to its plasticity to solubilize phosphate under different alkaline-sodium conditions. The BSFRA group showed a high genetic biodiversity composed exclusively of members of the family Pseudomonadaceae and the order Enterobacteriales (the latter being the most dominant), distributed to, at least, 7 bacterial genera. The genus Pantoea was the most abundant with 9 genetically different strains. Based on their plant growth promotion capabilities, in addition to the "use of safe microorganisms" criterion, P. eucalypti strains MA66, P76, P63, P163 and P173 were selected for both in vitro and in planta comparative studies. All P. eucalypti strains displayed in vitro PGPR attributes providing evidence of their potential promoter effect in plants. However, when they were evaluated in the Rhizobia- PGPR-legume tripartite system in alkaline-sodic soils, they showed remarkable differential effects on the growth variables such as total, shoot and nodule dry weight, as well as on the concentration and accumulation of P, N and Zn. These results revealed the strong intra-species variability and the complexity of plant-microorganism interactions, as well as the importance of in planta evaluation for the selection of promising strains for the elaboration of bioformulates. Simultaneously, another prospective analysis of the rhizobial symbiont community associated to L. tenuis was carried out. To this end, a community of 126 infective rhizobia was analyzed and revealed to be genetically very diverse; in addition to being dominated -although not exclusively- by members of the genus Mesorhizobium, other members of the Phyllobacteriaceae family (Aminobacter and Phyllobacterium) were also identified. Through the characterization of tolerance to saline and/or alkaline conditions, it was found that the community of infective symbionts is mostly sensitive to such conditions in vitro. The same pattern of behavior was observed in an in vivo system with soil from alkaline-sodic lowlands, although the latter was not as restrictive as the former. The comparison of the results obtained in both systems evidenced the complexity of the adaptation mechanisms of rhizobia to abiotic stress of the environment. Among the whole community of infective rhizobia, the Aminobacter group was identified as the most outstanding one because its adaptive capabilities to saline-alkaline conditions both in vitro and soil. From these results, a rhizobial strain of the genus Aminobacter tolerant to alkaline-sodic conditions was used to deepen the knowledge about its tolerance mechanisms. Aminobacter sp. BA135 was selected as a model organism for the identification of tolerance mechanisms to saline-alkaline conditions. Two groups of genes involved in the response to salinity or salinity and alkalinity simultaneously were identified by random mutagenesis. While among the strategies of response to salinity were the modification of the bacterial wall structure, the use of compatible osmolytes and the control of oxidative stress, against salinealkaline stress, the regulation of homeostasis was identified as the main response strategy, followed by the modulation of bacterial wall metabolism and the activation of stress response genes. In addition, cobalamin (vitamin B12) was identified as an important molecule for alkaline-salt stress tolerance. Complementarily, a transcriptomic study showed that BA135 employs a variety of complex and coordinated strategies in order to maintain core functions and ensure cell viability, including regulation of homeostasis, storage of carbon sources, control of reactive oxygen species (ROS) levels, expression changes in substrate transport systems, optimization of energy resources, expression of stress response genes, and accumulation of osmoprotectants. This study also revealed an interesting connection between cobalamin-dependent methionine synthesis and glycine-betaine compatible solute metabolism under stress conditions.