Determination of exosomal cancer stem cell biomarkers with cancer diagnostic utility

Abstract

Malignant melanoma (MM) is the most aggressive and life-threatening form of skin cancer and its incidence rapidly continues increasing worldwide. This type of cancer is often curable, but only if detected early. When diagnosed in early stages of disease (I and II), it has an excellent prognosis, but the mortality rate drastically rises in advanced stages (III and IV) after distant spread. Despite the progress made in recent years, diagnosis of MM remains challenging. To date, there are no suitable clinical diagnostic, prognostic or predictive biomarkers for this neoplasia. Several candidate biomarkers have been proposed but few have reached clinical application. Thus, there is still an urgent need for discovering specific useful biomarkers and for developing methods that can sensitively detect this neoplasia at the earlier pre-metastatic stages. It is known that the extraordinary metastasis capacity and chemotherapy resistance of this type of cancer are mainly due to intratumoral heterogeneity and, specifically, to MM cancer stem cells (CSCs). These cells represent a subpopulation of cancer cells which possess stem-like functional properties such as self-renewal ability and multipotency, and they are responsible for tumor initiation, progression, therapy resistance, relapse and metastasis. In addition, accumulating evidence supports the idea of the multiple roles that exosomes play in cancer’s biology. These small extracellular vesicles are involved in cell-to-cell communication and, by transferring their cargo, cancer cell-derived exosomes are able to induce in target cells diverse signalling pathways involved in tumor initiation, sustenance, progression and metastasis. These tiny messengers are actively released by all cells, including CSCs, to the extracellular matrix and to the bloodstream, making of them an interesting source of circulating biomarkers that can be easily isolated from the different body fluids by liquid biopsies. In this context, several omics technologies and analytical platforms, such as metabolomics and LC-HRMS, represent powerful tools for detecting and analyzing the expression levels of circulating metabolites in liquid biopsies that might serve as potential biomarkers not only for cancer, but also for other diseases. Taking all these facts into account, the main goal of this study was to identify potential CSC-derived exosomal and serological biomarkers using metabolomics techniques (LC-HRMS) with diagnostic, prognostic or predictive value for malignant melanoma. First, a patient-derived MM cell population enriched in CSCs was appropriately characterized. Next, exosomes derived from those MM-CSCs and serums from patients with MM were also characterized and their metabolomic profile was analyzed by LC-HRMS following an untargeted approach and applying univariate and multivariate statistical analyses. These analyses revealed significant metabolomic differences between exosomes derived from MM-CSCs compared to those from MM differentiated cells, as well as between serum-derived exosomes from patients with MM at several stages of disease and those derived from healthy individuals. Various metabolites showed a clear differential pattern of expression across the different sample groups of comparison and some of them were tentatively identified. Interestingly, we identified similarities in some structural lipids from both CSC-derived exosomes and those derived from patients with MM, such as the glycerophosphocoline PC 16:0/0:0. According to biomarker evaluation models, all those differential metabolites showed an excellent discrimination capacity between the two groups of samples (patients with MM and healthy controls), suggesting that they could be considered as potential exosomal biomarkers for this disease. Taking together, these results proved that metabolomic characterization of CSC-derived exosomes sets an open door to the discovery of clinically useful biomarkers for MM diagnosis. Along the same line and aiming at the same objective, another similar metabolomic study was also carried out but using a larger sample size. A total of 105 serum samples from both healthy individuals and patients with MM were analysed by LC-HRMS, following a similar nontargeted approach. Here again, significant metabolomic differences were found between patients in stage I of disease and healthy controls, and 10 candidates were consequently selected and identified as different classes of glycerophospolipids such as glycerophosphoethanolamines (PEs), glycerophosphocholines (PCs), cytidine diphosphate diacylglycerol (CDP-DG), or oxidized glycerophospholipids (POB-PS and PKOHA-PG). They all were suggested as potential biomarkers for early diagnosis of MM, since they yielded remarkable diagnostic capacities based on ROC curves analyses and biomarker evaluation models. All together, the results presented herein provide evidence that metabolomics and LCHRMS analytical platforms represent powerful tools for the identification and quantification of exosomal and serological metabolites in liquid biopsies, which could serve as potential biomarkers not only for MM, but also for other types of cancer. Given we are living in the era of effective molecular targeted treatments and immunotherapies, the discovery, validation and implementation into clinic of suitable biomarkers is more necessary than ever. Consequently, more funding and research are needed in order to find suitable biomarkers that could aid or improve early and accurate MM diagnosis. In this regard, untargeted LC-MS-based metabolomics applied to liquid biopsies and circulating compounds could pave the way for those achievements, since studies like this demonstrate its value for biomarker research, as well as its general applicability for translational research and precision medicine in oncology.

El melanoma maligno (MM) es el tipo de cáncer de piel más agresivo y potencialmente mortal que existe, y su incidencia mundial sigue aumentando actualmente a un gran ritmo. Este en particular, es un tipo de cáncer altamente curable, pero solo si se detecta a tiempo. Cuando se diagnostica en un estadio temprano de la enfermedad (I y II), tiene un pronóstico excelente, pero la tasa de mortalidad aumenta notablemente en los estadios avanzados (III y IV) cuando se ha diseminado a otras partes del cuerpo. A pesar de todos los esfuerzos que se han realizado en los últimos años, el diagnóstico del MM sigue presentando dificultades. Por el momento, todavía no existen biomarcadores diagnósticos, pronósticos o predictivos adecuados para esta neoplasia. Aunque varios biomarcadores candidatos han sido propuestos, pocos han demostrado ser eficaces para su aplicación en la práctica clínica. Por tanto, aún existe una urgente necesidad de descubrir biomarcadores útiles específicos y desarrollar métodos sensibles que puedan detectar esta neoplasia en sus etapas tempranas pre-metastásicas. Se sabe que la extraordinaria capacidad de metástasis y resistencia a la quimioterapia de este tipo de cáncer se debe principalmente a la heterogeneidad intratumoral, y en particular a las células madre cancerígenas (CMCs). Estas células representan una subpoblación de células tumorales que poseen propiedades funcionales similares a las de las células madre, como la capacidad de auto-renovación y diferenciación en distintos tipos celulares, y son responsables del inicio, progresión, resistencia a la terapia, recaída y metástasis de los tumores. Por otra parte, numerosas investigaciones respaldan las múltiples funciones que desempeñan los exosomas en la biología del cáncer. Estas pequeñas vesículas extracelulares están implicadas en la comunicación intercelular y, al transferir su carga, los exosomas derivados de células cancerígenas pueden inducir en las células diana diversas vías de señalización implicadas en la formación, el sustento, la progresión y la metástasis del tumor. Estos diminutos mensajeros son liberados activamente por todas las células, incluidas las CMCs, a la matriz extracelular y al torrente sanguíneo, lo que los convierte en una interesante fuente de biomarcadores circulantes fácilmente aislables de los diferentes fluidos corporales mediante biopsias líquidas. En este contexto, varias tecnologías ómicas y plataformas analíticas, como la metabolómica y la cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas de alta resolución (LC-HRMS), representan poderosas herramientas para detectar y analizar los niveles de expresión de metabolitos circulantes que podrían servir como potenciales biomarcadores no solo en cáncer, sino también en otras enfermedades. Por todo ello, el objetivo principal de este estudio fue identificar posibles biomarcadores exosomales y serológicos derivados de CMCs mediante el uso de técnicas metabolómicas (LCHRMS) con valor diagnóstico para el melanoma maligno. En primer lugar, se caracterizó adecuadamente una población de células de MM enriquecidas en CMCs, en una línea celular primaría derivada de un paciente con MM. A continuación, también se caracterizaron los exosomas derivados de esas CMCs de MM y de sueros de pacientes con MM y se analizó su perfil metabolómico mediante LC-HRMS siguiendo una aproximación no dirigida y aplicando análisis estadísticos univariados y multivariados. Estos análisis revelaron diferencias metabolómicas significativas entre exosomas derivados de CMCs de MM en comparación con los de células diferenciadas de MM, así como entre exosomas derivados de suero de pacientes con MM en distintos estadios de la enfermedad y los derivados de individuos sanos. Varios metabolitos presentaron un patrón claro de expresión diferencial entre los diferentes grupos de muestras comparadas y a algunos de ellos se les pudo asignar una identificación tentativa. Curiosamente, se detectaron ciertas similitudes en algunos lípidos estructurales de los exosomas derivados de CMCs y los derivados de pacientes con MM, como la glicerofosfocolina PC 16: 0/0:0. En base a los modelos de evaluación de biomarcadores generados, todos los metabolitos diferenciales mostraron una excelente capacidad de discriminación entre los dos grupos de muestras (pacientes con MM y controles sanos), siendo por tanto susceptibles de ser considerados como potenciales biomarcadores exosomales de esta enfermedad. En conjunto, estos resultados demostraron que la caracterización metabolómica de exosomas derivados de CMCs abre una puerta al descubrimiento de biomarcadores clínicamente útiles para el diagnóstico del MM. En la misma línea y con el mismo objetivo, también se llevó a cabo otro estudio metabolómico similar pero con un tamaño de muestra mayor. Un total de 105 muestras de suero de pacientes con MM y de individuos sanos fueron analizadas por LC-HRMS, siguiendo una aproximación no dirigida similar. De nuevo, se encontraron diferencias metabolómicas significativas entre pacientes en estadio I de la enfermedad y controles sanos, por lo que se seleccionaron 10 candidatos que fueron identificados como distintos tipos de glicerofoslípidos, como glicerofosfoetanolaminas (Fes), glicerofosfocolinas (FCs), citidín difosfato diacilglicerol (CDP-DG) o glicerofosfolípidos oxidados (POB-PS y PKOHA-PG). Todos ellos fueron sugeridos como posibles biomarcadores para el diagnóstico precoz del MM, ya que mostraron notables capacidades diagnósticas basadas en análisis de curvas ROC y los modelos de evaluación de biomarcadores. En conjunto, los resultados presentados en este trabajo demuestran que la metabolómica y las plataformas analíticas LC-HRMS, representan una poderosa herramienta para la identificación y cuantificación de metabolitos exosomales y serológicos en biopsias líquidas, que podrían servir como posibles biomarcadores no solo para MM, sino también para otros tipos de cáncer. Puesto que estamos viviendo una era de múltiples tratamientos moleculares dirigidos e inmunoterapias eficaces, el descubrimiento, la validación y la implementación en la clínica de biomarcadores adecuados son más necesarios que nunca. En consecuencia, todavía se necesita más financiación y más esfuerzos de investigación para encontrar biomarcadores adecuados que puedan ayudar o mejorar el diagnóstico temprano y preciso del MM. En este sentido, la metabolómica no dirigida basada en LC-MS aplicada a biopsias líquidas y compuestos circulantes podría allanar el camino hacia esos logros, ya que estudios como este demuestran su valor para la investigación de biomarcadores, así como su aplicabilidad general a la investigación traslacional y a la medicina de precisión en oncología.