Construcción de vectores basados en la proteína fluorescente verde para análisis genético en bacterias

Abstract

El gen gfp que codifica para la proteína verde fluorescente (GFP) fue utilizado para crear una serie de plásmidos y un minitransposon registradores para el análisis genético. y la monitorización de bacterias. El sistema registrador está integrado en un plásmido para estudio de promotores y en un minitransposon para generar fusiones transcripcionales por inserción al azar en el cromosoma. Con el objeto de mejorar los niveles de sensibilidad necesarios para el uso del sistema en monocopia y para la detección en células individuales, el extremo 3'del gen gfp fue reemplazado por el de otro gen gfp mofidicado que emite luz verde 45 veces más fuerte que la GFP natural. Además, al extremo S' del nuevo gen gfp se fusionó la señal estimuladora de la traducción del gen atpE. La conjugación del minitransposon a dos Pseudomonas spp. diferentes y a Alcaligenes eutrophus produjo fusiones al azar en el cromosoma, de las que un 5% emitían fluorescencia detectable a ojo. La expresión de GFP en células aisladas fue perfectamente visualizada por microscopía de fluorescencia.

The green fluorescent protein (GFP) gene, gfp, was used to develop versatile reporter systems for genetic analysis in, and monitoring of bacteria. The reporter system is available on a plasmid and on a mini-transposon located in a suicide delivery plasmid for generation of chromosomal fusions. To achieve sensitivity levels necessary for use in monocopy and for detection of single cells, the 3'-end of gfp was replaced by that of a modified gfp gene characterized by a 4S-fold stronger signal than that exhibited by the natural OFP, and the modified gfp gene equipped with the strong translation signals of the atpE gene. Transfer of the minitrasnposon into two different Pseudomonas spp. and Alcaligenes eutrophus produced random chromosomal fusions, some 5% of which exhibited fluorescence detectable by eye. Individual OFP+ cells were readily observed by fluorescence microscopy. The detailed map of the step-by-step construction is depicted.