Caracterización molecular de un retrotransposón sin-LTR. Organización genómica y modelo de integración

Abstract

L1Tc es un retrotransposón no-LTR, disperso en el genoma de Trypanosoma cruzi, que se transcribe activamente a ARN poliadenilado. Este elemento presenta en su extremo 3'un fragmento de la secuencia altamente repetida E 12 Y en su extremo 5'una secuencia tipo RIME (elemento ribosomal móvil). Se ha caracterizado una región genómica de la cepa CI de T. cruzi; en la que se encuentran 3 copias de L1Tc organizadas en tandem. Secuencias repetidas como E13 y DGF-l se encontraron corriente arriba de la región genómica que contiene las tres copias de L1Tc. En la cepa Maracay ha sido descrita una región del genoma de igual organización y secuencias pero que carece de L1Tc. La secuencia de aminoácidos del ORF1 de L1Tc presenta una homología significativa con secuencias de la familia de endonucleasas AP. El análisis de la actividad enzimática de la proteína recombinante, llamada NL1Tc, obtenida de la expresión del ORF1 de L1Tc en un sistema de expresión, reveló que la secuencia codifica para una proteína con actividad endonucleasa. Ensayos de complementación en la cepa de E. coli BW286, que tiene una delección en el gen de la exonucleasa III, muestran que la expresión in vivo de la proteína NLITc confiere viabilidad a la bacteria mutante. Nosotros proponemos que NL1Tc genera sitios 3'OH libres en el ADN cromos6mico necesarios para la retrotransposici6n de LITc.

L1Tc is a non-L TR retrotransposon, dispersed throughout the genome of Trypanosoma cruzi, actively transcribed into poly (A)+ RNA. This element has at its 3' end a fragment of a highly repetitive sequence E 12 and at its 5'end a ribosomal mobile element-like sequence. A genomic regíon of T. cruzi CL strain containing 3 copies of LI Tc, tandemly organized, has been characterized. Upstream of the genomic region containing the three copies we found repeated sequences as E13 and DGF-l. A genomic region with the same organization and sequences, but lacking LI Tc, was found in the Maracay strain. The deduced aminoacid sequence ofORFl ofLlTc exhibíts a significant homology with sequences of the AP endonuclease protein family. The analysis of the activity of the 40Kd recombinant protein, named NLlTc, obtained from the expression of the LlTc ORFI in a E. coli in vitro expression system, revealed that the sequence codes for a protein with endonuclease activity. Date are also presented showing that in vivo expression ofNLITc protein conferred viability by complementation to E. coli exonuclease III deletion mutants (BW286 strain). We propose that NLlTc generates free 3'OH sites in the chromosomal DNA necessary for LlTc retrotransposition.