Síntesis de nuevos compuestos inhibidores de glicolato oxidasa. Aplicación en hiperoxaluria primaria y evaluación biológica

Abstract

La hiperoxaluria primaria tipo 1 (HP1) es una enfermedad rara hereditaria causada por un déficit de la enzima hepática alanina-glioxilato aminotransferasa (AGT), encargada de la detoxificación de glioxilato. Como consecuencia, se produce una acumulación de su sustrato, el glioxilato, que pasa a ser oxidado a oxalato principalmente por la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) en el citoplasma, y en menor medida, por la enzima glicolato oxidasa (GO), en el peroxisoma. La enzima GO, además, cataliza la producción de glioxilato a partir de glicolato. Dado que el oxalato constituye un producto final del metabolismo, una vez superada su capacidad de excreción renal, comienza a formar depósitos insolubles de oxalato cálcico afectando inicialmente a hígado y riñón, y extendiéndose finalmente a nivel sistémico, siendo el trasplante renal y hepático la única opción curativa para estos pacientes. La terapia de reducción de sustrato (SRT) destaca entre las estrategias actuales que persiguen la búsqueda de un tratamiento no quirúrgico para la enfermedad. En este sentido, la enzima GO ha sido validada como una diana eficiente y segura para la terapia de reducción de sustrato en un modelo de HP1 de ratón. En base a ello, y considerando los requisitos estructurales previamente establecidos para el desarrollo de inhibidores de GO, se ha llevado a cabo la preparación de dos nuevas familias de compuestos inhibidores de GO: los derivados de ácido oxámico y los derivados de ácido salicílico. En la estructura de todos ellos se ha mantenido una cabeza polar, ya sea derivada de ácido oxámico o salicílico, y una cadena lateral hidrofóbica, para la cual se han explorado diferentes opciones de sustitución. Así, se ha llevado a cabo la síntesis, purificación y caracterización de un total de 70 compuestos, así como su evaluación biológica frente a la enzima GO aislada y en hepatocitos de ratón hiperoxalúrico, con objeto de determinar su eficacia en la reducción de oxalato. Dentro de los derivados de ácido oxámico, el ácido N-octiloxámico, un inhibidor GO de referencia, se tomó como modelo para el desarrollo de tres subfamilias de compuestos: derivados del ácido 2-oxoacético, 3-oxopropanoico y 4-oxobutanoico. En cuanto a los derivados de ácido salicílico, los furilsalicilatos inicialmente sintetizados demostraron ser inhibidores de GO moderados y agentes eficaces en la reducción de oxalato en cultivos, con valores de CE50 en el rango micromolar bajo. Estos furilsalicilatos sirvieron además como base para la modulación estructural, de forma que se exploró la introducción de espaciadores tanto rígidos como flexibles entre la cabeza polar y la cola hidrofóbica, así como diferentes opciones de cadena lateral. Como resultado, se consiguió mejorar en gran medida la potencia contra GO. Gracias a los estudios de docking se pudo predecir el modo de unión de los derivados de ácido salicílico a la enzima GO, y esto, junto a la información biológica obtenida de estos compuestos, llevó al establecimiento de relaciones estructura actividad preliminares para salicilatos inhibidores de GO y con capacidad para reducir oxalato en cultivos celulares. Para algunos compuestos se observaron discrepancias entre la actividad contra la enzima GO y la actividad fenotípica en células. Por ello, con objeto de determinar posibles dianas biológicas alternativas mediante las cuales estos compuestos podrían estar ejerciendo su efecto biológico de reducción de oxalato, algunos compuestos representativos fueron evaluados frente a la enzima LDH, también implicada en la producción de oxalato. Como resultado, los derivados de ácido salicílico, en concreto los aminometilfuril derivados, han sido identificados como potentes inhibidores dobles GO/LDHA. Esto, junto con su estructura drug-like y su sencilla síntesis en dos pasos usando la reacción de Suzuki y la aminación reductora, los convierte en compuestos prometedores para el desarrollo de una aproximación multi-diana para abordar el tratamiento de HP1.

Primary hyperoxaluria type 1 (PH1) is an inborn error of liver metabolism caused by a deficiency in the hepatic enzyme alanine-glyoxylate aminotransferase (AGT), which is in charge of glyoxylate detoxification. The consequent accumulation of the substrate, glyoxylate, leads to its oxidation into oxalate mainly by the enzyme lactate dehydrogenase (LDH) in the cytosol and, in a minor extent, by glycolate oxidase (GO) in the peroxisome. GO also catalyzes glyoxylate production from glycolate. Since oxalate constitutes and end-product of the metabolism, once the renal excretion is exceeded, it starts depositing as insoluble calcium oxalate crystals that initially damage kidneys and liver, and ends causing systemic oxalosis, being the combined kidney-liver transplantation the unique healing option for these patients. One of the current approaches aiming at the search of a non-surgical treatment for the disease is the substrate reduction therapy (SRT). In this sense, GO has been validated as a safe and efficient target for SRT in a PH1 mouse model. On that basis, and considering the structural requirements previously established for the development of GO inhibitors, two new families of GO inhibitors have been prepared: oxamic acid derivatives and salicylic acid derivatives. All of them share a common structure with a polar head, either salicylic acid or oxamic acid-based, and a hydrophobic side chain, for which different substitution options have been explored. Thus, a total of 70 compounds have been synthesized, purified and characterized, as well as evaluated against isolated GO and in hyperoxaluric mouse hepatocytes, so as to determine their efficacy on oxalate diminution. Within the oxamic acid derivatives, N-octiloxamic acid, an established GO inhibitor, was used as reference for the development of three new sub-families: 2-oxoacetic, 3-oxopropanoic, and 4-oxobutanoic acid derivatives. Regarding the salicylic acid derivatives, the furylsalicylates initially synthesized resulted to be moderate GO inhibitors and efficient agents decreasing oxalate in cultures, with EC50 values at the low micromolar range. These furylsalicylates also served as a base for structural modulation, so that the introduction of both flexible and rigid spacers between the polar head and the side chain was explored, as well as different side chain options. As a result, potency against GO was considerably improved. Docking studies allowed the binding mode prediction of the salicylic acid derivatives with GO, and this, along with the biological data gathered for these compounds, led to the establishment of preliminary structure-activity relationships for salicylates with activity as GO inhibitors and capacity to decrease oxalate production in cell culture. For some compounds, discrepancies between the activity against GO and the phenotypic effect in cells were observed. Thus, so as to determine the existence of alternative biological targets whereby these compounds might be exerting their biological effect, representative compounds were tested against LDH, which is also involved in oxalate production. As a result, salicylic acid derivatives, specifically aminomethylfuryl derivatives, have been identified as potent dual GO/LDHA inhibitors. This, along with their drug-like structure and easy two-step synthesis, makes them promising candidates for the development of a multi-target approach for the treatment of PH1.