Caracterización molecular del gen E de la familia glicoproteína-P de Leishmania tropica

Abstract

El objetivo de la presente tesis doctoral ha sido la caracterización molecular del gen ltrpgpe sobrexpresado en la línea de leishmania tropica resistente a 1 mm de metotrexato. el aislamiento del gen se realizo mediante rastreo de una genoteca del parasito resitente a metrotexato, usando una sonda especifica para el gen ltpgpe de l. tarentolae. se aisló un clon en el que se encontro un marco abierto de lectura que codificaba para una proteina de 1677 aminoácidos, con un peso molecular estimado de 186 kda. se encontró que el gen ltrpgpe mantenía homologia significativa con miembros de la superfamilia abc y que la máxima homologia era mantenida con glicoproteinas-p de l. tarentoale no relacionadas con fenotipo mdr. el gen fue localizado en un cromosoma de 1500 kb, organizado como un gen de copia única, detectando un polmorfismo en el locus que contiene al gen lrpgpe. el estudio de la funcionalidad del gen ltrpgpe fue llevado a cabo sobre los parásitos transfectados con el gen ltrpgpe y fue enfocado en primer lugar hacia un estudio del posible papel de la proteína en resistencia a fármacos. para ello se determinaron los índices de resistencia frente a una amplia variedad de compuestos. los resultados obtenidos mostraron que bajo las condiciones experimentales usadas el gen ltrpgpe confiere bajos niveles de resistencia a derivados de arsénico. en segundo lugar quisimos saber si el gen se encuentra modificando el ph citoplasmtico, papel que ha sido atribuido a otras glicoproteinas-p. se realizaron medidas de ph intracelular tanto en parásitos silvestres como trasfectados con el gen encontrando que el ph intracelular de leishmania tropica no se veia afectado por la sobreexpresion del gen itrpgpe. por ultimo se determino en los parásitos transfectados con el gen ltrpgpe el posible papel regulador atribuido a las glicoproteinas-p sobre la actividad de canales aniónicos activados por choque hipotónico