Caracterización espectroscopica y estructural de biliproteinas procedentes de spirulina platensis : aplicaciones como marcadores fluroescentes

Abstract

Se han purificado las biliproteinas presentes en la microalga spirulina platensis: c-pc y apc. Se han separado eficazmente las subunidades que las constituyen en condiciones de desnaturalización, por cromatografia de hplc en fase reversa, lo que ha permitido corroborar la pureza, anteriormente comprobada por espectrofotometria y sds-page. Se ha obtenido y purificado el cromoforo ficocianobilina, único presente en ambas biliproteinas, mediante metanolisis y posterior extracción con disolventes orgánicos, habiéndose demostrado su mediante hplc en fase revesa. Mediante el método de acupuntura en gelse han cristalizado ambas biliproteinas. La calidad de los cristales obtenidos ha permitido su caracterización mediante difracción de rayos-x. Los cristales de ambas proteínas pertenecen al sistema hexagonal. c-pc al grupo espacial p6 o p63 mientras que para apc se ha asignado el grupo p6322, habiéndose determinado sus parámetros de red. Las propiedades espectroscopicas de absorción y emisión de ambas biliproteinas no se alteran apreciablemente en los intervalos de temperatura y ph comprendidos entre 30-50 grados c y 4-9 respectivamente. Mediante espectroscopia ft-ir se ha determinado la estructura secundaria de la biliproteinas en disolución. Los espectros de polarización de fluorescencia muestran la existencia de distintos tipos funcionales de cromoforos. Si se admite la existencia de cromoforos sensibilizantes y fluorescentes, se puede deconvolucionar el espectro de absorción de las biliproteinas demostrando la eficaz transferencia de energía cuando ambas biliproteinas se encuentran en estado de agregación trimerico. Mediante una sencilla metodología se ha modificado el ácido polirribocitidilico poli (c) y se ha unido a la mediante conjugación efectiva la biliproteina correspondiente. Los conjugados obtenidos son de utilidad en la detección fluorimetrica de la hibridación con ácido polirriboinosinico poli (i). Referida hibridación se puede detectar en medios homogéneos mediante el aumento del grado de polarización de fluorescencia que ha resultado proporcional al porcentaje de híbrido formado. Se han incluido las biliproteinas en micelas reversas de aot en isooctano. El cromoforo se encuentra localizado en las inmediaciones de la interfacie molecular agua-surfactante. las biliproteinas se unan isnespecificamente al interior de la membrana celular de hematies