Caracterización genética y molecular de una cepa entomopatógena activa frente a la mosca de la fruta del Mediterráneo (Ceratitis capitata) para la búsqueda de factores de virulencia

Abstract

En este trabajo se presenta la caracterización realizada sobre la cepa Bacillus pumilus 15.1, previamente aislada por nuestro grupo de investigación. Esta cepa presenta una importancia relevante en Biotecnología debido a su actividad tóxica frente a larvas de Ceratitis capitata, una plaga ampliamente distribuida a nivel mundial. La caracterización realizada en este trabajo aporta información importante sobre el metabolismo (utilización de fuentes de carbón y nitrógeno), actividades enzimáticas, formación de biopelículas, motilidad, suceptibilidad a los antibióticos, y resistencia a agentes externos. Una de las características más relevantes descubiertas como consecuencia de esta caracterización fue la gran resistencia que presentaron las esporas y las células vegetativas de B. pumilus 15.1 al efecto de la radición UV-C; las células vegetativas alcanzaron valores de supervivencia mucho más altos que los de las cepas de Bacillus thuringiensis (Bt) y Bacillus subtilis ensayadas en este estudio. La caracterización realizada permitió descubrir que B. pumilus 15.1 posee dos elementos extracromosómicos; uno de ellos, el plásmidos pBp15.1S fue subclonado, secuenciado, ensamblado y su secuencia analizada en busca de factores de virulencia. En la caracterización morfológica de la cepa B. pumilus 15.1, durante el crecimiento del cultivo bacteriano, se observó la producción de cristales paraesporales semejantes a los producidos por la bacteria Bt y responsables principales de la toxicidad entomopatógena de la bacteria. En este trabajo se caracterizaron los cristales paraesporales de la cepa B. pumilus 15.1. Para determinar el origen de su codificación, se obtuvo una cepa curada de elementos extracromosómicos denominda B. pumilus 15.1C. Se relacionó la producción de los cristales con el perfil proteico de la cepa con lo cual se pudo deducir que el componente mayoritario de los cristales paraesporales observados fue una proteína de 45 kDa. La caracterización de esta proteína mostró que es resistente a la tripsina y que presenta un peculiar mecanismo de solubilización. Se realizaron análisis de MALDI-TOF y secuenciación del extremo N-terminal de la proteína con objeto de proceder a su identificación. Además, mediante la técnica shotgun se obtuvo la secuencia del genoma de B. pumilus 15.1, el cual fue ensamblado, anotado y puesto a disposición de la comunidad científica en la base de datos del NCBI. Para buscar posibles factores de virulencia en el genoma de la cepa, se creó una base de datos con todos los factores tóxicos frente a insectos de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. El resultado de esta búsqueda fue el hallazgo de que en el genoma de B. pumilus 15.1existen genes codificantes para proteínas homólogas a dos proteínas recientemente descritas como factores de virulencia en otras bacterias, además de quitinasas, metaloproteasas, citolisinas y antibióticos. En este trabajo de investigación se describe por primera vez la caracterización de una cepa entomopatógena de la especie B. pumilus, además de proporcionar información sobre los posibles factores de virulencia de la cepa B. pumilus 15.1.