Análisis funcional de un elemento no ltr retrotansposon de trypanosoma cruzi :l1tc

Abstract

El L1Tc es un elemento móvil y pertenece al grupo de los retrotransposones no-LTR. Su tamaño es de 5 kb y su secuencia mostró la presencia de tres marcos de lectura (ORF) diferentes, el primero presenta homología con secuencias ya descritas como enzimas reparadoras de la familia AP (Demple, B. y col.; Proc. Natl.Acad.Sci.USA.88, 1991), el ORF2 presenta homología con los dominios transcriptasa inversa y el ORF3 presenta homología con proteínas con dominios de unión a ácidos nucleicos. Se asume que para que un retrotransposón pueda transponer de forma autónoma debe codificar para tres tipos de actividad : capacidad de unión a ARN, actividad transcriptasa inversa y reconocimiento de sitio de integración. Según la descripción, el elemento L1Tc llena los tres requerimientos, donde el ORF2 podría estar codificando para la actividad transcriptasa inversa, el ORF3 presenta dos sitios que pueden tener capacidad de unión a ARN y el sitio de reconocimiento para la integración puede darse por la actividad endonucleasa de la proteína de la familia AP codificada en el ORF1. Además, varios autores han sugerido la presencia de actividad transcriptasa inversa en tripanosomátidos, aunque sea a niveles muy bajos para explicar la existencia de criptogenes editados sustituyendo a los criptogenes originales en los maxicirculos (Simpson, L. y col., Science. 1994). Sin embargo, en tripanosomátidos hasta el momento sólo se ha detectado actividad transcriptasa inversa en Crithidia fasciculata asociada al retrotransposón CRE1 (Gabriel, A. y col.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991). Dado que el L1Tc presenta un ORF que contiene los dominios conservados en todas las transcriptasas inversas, en este trabajo de tesis doctoral se demostró no sólo que la proteína codificada en este marco de lectura presenta una actividad transcriptasa inversa dependiente de cationes divalentes, tiene capacidad para utilizar diferentes combinaciones molde/iniciador, incluyendo tanto homopolímeros de ribonucleótidos, deoxinucleótidos como ARN heterólogo sino que esta actividad está presente en homogeneizados del parásito T. cruzi, mayoritariamente a nivel nuclear con requerimientos similares y siendo sensible a la presencia de inhibidores específicos de las transcriptasas inversas retrovirales. La zona carboxiloterminal de la proteína recombinante localizada corriente abajo de los dominios consenso transcriptasa inversa no es imprescindible para dicha actividad, aunque presenta una ligera disminución en su actividad enzimática. La mutación del segundo ácido aspártico del dominio catalítico consenso de las transcriptasas inversas, conduce a la abolición de la actividad. La proteína recombinante codificada por el ORF2 del elemento L1Tc presenta una actividad RNasa H asociada, los requerimientos iónicos son similares a los descritos para RNasas H de retrovirus y contrarios a los referidos para la enzima de E. coli. Esta actividad RNasa H está localizada en la región carboxiloterminal y conserva los aminoácidos presentes en el sitio catalítico de enzimas de este tipo asociadas a las transcriptasas inversas de retrovirus, así como a RNasas H descritas en bacterias, parásitos y levaduras, estos aminoácidos se mantienen conservados en la mayoría de los retroelementos no-LTR descritos. En este trabajo de tesis doctoral también se demostró la capacidad de la zona 5' no traducida del elemento L1Tc de dirigir la expresión de un gen foráneo clonado corriente abajo de dicha región, por lo tanto ésta podría estar actuando como promotor interno del elemento L1Tc de la misma forma que se ha descrito la presencia de promotores internos para otros retrotransposones del tipo no-LTR. Todos estos datos demuestran que el retrotransposón L1Tc es un elemento activo y autónomo ya que codifica las proteínas necesarias para su propia transposición