Hyaluronidase pre-treatment enhances collagen staining in sturgeon notochord

Abstract

Objective: The current study aimed to design a histological method to determine the presence and organization of the collagen network in sturgeon notochord. Methods: Serial sections of sturgeon notochord (Acipenser naccarii) were used and assigned to two different experimental groups: Hyaluronidase pre-treatment (HP) in an alcohol acid solution (1% HCl in 70% alcohol solution) for 15 min and hyaluronidase solution in a 2 µg/ ml concentration (pre-heated at 37º C), and control (CTR) group, without pre-treatment. Then, the ECM was assessed by two histochemical methods: Picrosirius Red (PR) staining for 30 min with Sirius red (0.1% of Sirius red in saturated aqueous picric acid), for collagen bundle staining, and Alcian Blue (AB) staining for glycosaminoglycans detection. Results: Samples analyzed in this study showed positive histochemical reaction for collagen fibers in both experimental groups. Referring to PR staining, the CTR group presented a larger and homogeneous reaction was observed in the entire samples, whereas HP group presented a more definite and intense pattern of collagen network. Also, this more intense signal in HP group matched with an increase of birefringence in polarized microscopy images of PR. However, HP group showed a lower intense and more heterogeneous signal when was compared with CTR group in AB staining. Conclusion: Using a simple histological example, our study illustrates the capability of a hyaluronidase pre-treatment to enhance picrosirius red staining in sturgeon notochord trough light and polarized microscopy.

Objetivo: El presente estudio tiene por objetivo diseñar un método histológico para determinar la presencia y organización de la red de colágeno en la notocorda del esturión. Métodos: Secciones seriada de la notocorda de esturión (Acipenser naccarii) fueron utilizadas y se asignaron a dos grupos experimentales diferentes: pretratamiento de hialuronidasa (HP) en una solución de alcohol ácido (HCl al 1% en solución de alcohol al 70%) durante 15 minutos y posteriormente a una solución de hialuronidasa en una concentración de 2 μg / ml (precalentada a 37º C) y grupo de control (CTR), sin tratamiento previo. Luego, la ECM se evaluó mediante dos métodos histoquímicos: tinción Picrosirius Red (PR) durante 30 minutos con rojo Sirio (0,1% de rojo Sirio en una solución saturada de ácido pícrico), para la tinción de colágeno; y tinción con Alcian Blue (AB) para detección de glicosaminoglicanos. Resultados: Las muestras analizadas en este estudio mostraron una reacción histoquímica positiva para las fibras de colágeno en ambos grupos experimentales. Con respecto a la tinción PR, el grupo CTR presentó una reacción mayor y más homogénea en toda la superficie de las muestras, mientras que el grupo HP presentó un patrón red de colágeno más definido e intenso. Además, esta señal más intensa en el grupo HP coincidió con un aumento de la birrefringencia en las imágenes de microscopía polarizada de PR. Sin embargo, el grupo HP mostró una señal menos intensa y más heterogénea cuando se comparó con el grupo CTR en la tinción AB. Conclusión: Utilizando un ejemplo histológico simple, nuestro estudio ilustra la capacidad de un pretratamiento de hialuronidasa para mejorar la tinción de picrosirius en la notocorda del esturión a través de la luz y la microscopía polarizada.