Detección e identificación de componentes orgánicos en conchas de moluscos

Abstract

En moluscos, la matriz orgánica de la concha se compone de un gran número de proteínas, glicoproteínas y polisacáridos, que son secretados por el epitelio calcificante del manto, y que juegan un papel fundamental en las funciones de la síntesis de la concha. El estudio de la biomineralización se enfrenta a dos grandes retos, uno de ellos está representado por la microestructura lamelar cruzada, el otro por el nácar. La lamelar cruzada es con diferencia la microestrcutura más abundante, pero pese a ello apenas hemos comenzado a desvelar sus secretos. El nácar, es la microestructura más estudiada pero aun alberga muchas incógnitas, no solo en cuanto a su desarrollo, sino también en lo que respecta a la propia estructura. En este estudio, se ha caracterizado bioquímicamente la matriz asociada a la estructura lamelar cruzada de la concha reina, Lobatus gigas. Las matrices orgánicas soluble e insoluble representan una fracción minoritaria de la concha. Ambas están compuestas por una pequeña proporción de proteínas. De ellas se han purificado tres fracciones dominantes mediante electroforesis SDS-PAGE preparativa, denominadas como 1P3, 2P3 y 3P3, y posteriormente han sido caracterizadas. Comparada con otras matrices, ésta está débilmente glicosilada (3%). Sólo la fracción 3P3 se presenta notablemente glicosilada. La composición de azúcares muestra que la manosa es el monosacárido principal. Siendo la primera vez que se constata este dato. Las proteínas purificadas interaccionan con el carbonato cálcico durante el proceso de cristalización in vitro, pero esta interacción es moderada. Se empleó el anticuerpo obtenido frente a 3P3 se usó para localizar a estas proteínas en las conchas mediante inmunogold. Se han estudiado las fibras de quitina en conchas con estructura nacarada. Aunque de manera general se acepta que las fibras de quitina se presentan en las membranas interlamelares del nácar, la disposición de estas fibras ha sido discutida. Hasta ahora la mayoría de las observaciones se habían realizado en conchas desmineralizadas, donde la estructura original se pierde. En nuestro estudio hemos aplicado diferentes técnicas de marcaje (inmunofluorescencia directa e inmunogold) de las fibras de quitina en conchas no desmineralizadas. Hemos puesto así de manifiesto la disposición y la naturaleza de las diferentes fibras en la superficie del nácar sin desmineralizar, de los bivalvos Neotrigonia sp., Haliotis rufescens y Pteria Hirundo, trabajando con microscopía confocal y con microscopía electrónica de barrido (SEM). Durante el desarrollo experimental se encontraron evidencias de la presencia de quitina intracristalina en las plaquitas de nácar. Las observaciones realizadas, y los resultados experimentales, nos han ayudado a desvelar las dinámicas de crecimiento del nácar, mediante la interacción de la materia orgánica con el carbonato cálcico.

In molluscs, the shell organic matrix comprises a large set of biomineral-occluded proteins, glycoproteins and polysaccharides, that are secreted by the calcifying mantle epithelium, and display several and fundamental functions related to the synthesis of the shell. The study of biomineralization faces two major challenges, one is represented by the crossed-lamellar microstructure, the other by the nacre. The crossed-lamellar is the most abundant microstructure with difference, but nevertheless we have barely begun to reveal its secrets. Nacre, despite being the most studied microstructure, still harbors considerable uncertainties, not only in terms of its development, but also in regard to the structure itself. In the present PhD Thesis, we have characterized biochemically the shell matrix associated to the crossed-lamellar structure of the giant queen conch Lobatus gigas. The acid-soluble (ASM) and acid-insoluble (AIM) matrices represent an extremely minor fraction of the shell. Both are constituted by a few discrete polidisperse proteins. Among which, three fractions, obtained by preparative SDS-PAGE and named 1P3, 2P3 and 3P3, are dominant and were further characterized. Compared to other matrices, the acid-soluble matrix is weakly glycosylated (3%) and among the discrete components, only 3P3 seems noticeably glycosylated. The monosaccharide composition of the ASM shows that mannose represents the main monosaccharide. To our knowledge, this is the first report of a high ratio of this sugar in a skeletal matrix. Furthermore, the ASM interacts with the in vitro crystallization of calcium carbonate, but this interaction is moderate. It differs from that of the isolated 1P3 fraction but is similar to that of the 2P3 and 3P3 fractions. At last, antibodies developed from the 3P3 fraction were used to localize this fraction within the shell by immunogold. On the other hand, we have studied the chitin fibers in the interlamellar membranes of shell nacre. Although it is generally accepted that chitin is found as fibers in the interlamellar membranes of nacre, the disposition of these fibers has been discussed. So far most of the observations have been taken on previously demineralized shells, where the original structure disappears. We, however, have applied different labeling techniques (direct immunofluorescence and inmunogold) on non-demineralized nacreous shells. We have revealed the disposition and nature of the different fibers that can be observed on the surface of the nacreous shell of the bivalve Neotrigonia sp., Haliotis rufescens and Pteria hirundo by confocal microscopy and scanning electron microscopy (SEM). During the experimental development we found evidence of intracrystaline chitin in nacre platelets. They have helped to reveal the growth dynamics of nacre, through the interaction of organic matter with calcium carbonate.