Evaluación de la viabilidad celular y patrones apoptóticos en células madre aisladas de la pulpa dental humana

Abstract

Introducción: El desarrollo de sustitutos biológicos mediante Ingeniería Tisular requiere de la utilización de una fuente de células madre que, además de ser capaz de autorenovarse y diferenciarse, mantengan una funcionalidad y viabilidad óptima justo en el momento de su uso. El estudio de la viabilidad celular constituye un importante control de calidad, especialmente en aquellas poblaciones celulares con un alto potencial para su utilización en Ingeniería Tisular, como son las células madre de la pulpa dental (DPSC). El objetivo de este trabajo es la evaluación de la viabilidad durante los tres primeros subcultivos de células madre de la pulpa dental humana (hDPSC). Material y métodos: Se obtuvieron 3 subcultivos consecutivos de hDPSC de terceros molares humanos sanos (N = 3) mediante un proceso de digestión enzimática. La concentración intracelular de los iones sodio (Na), potasio (K), y cloro (Cl) fue determinada mediante microscopía analítica por energía dispersiva de rayos X (EPXMA). El porcentaje de células en apoptosis (fragmentación de DNA) fue determinado mediante el ensayo de fluorescencia TUNEL en el primer y tercer subcultivo. Resultados: En el segundo subcultivo se detectó un descenso significativo del potasio (p = 0,011) indicando un descenso en la viabilidad celular. En el tercer subcultivo, los niveles de cloro y sodio aumentaron de forma significativa (p = 0,010 y p = 0,002), generando un perfil iónico compatible con células en estado apoptótico. La fluorescencia a partir del ensayo TUNEL reveló 2,76 ± 1,80 % de células apoptóticas en el tercer subcultivo, mientras que en el primer subcultivo, dicha proporción fue de 0,55 ± 0,27%. Discusión: Las hDPSC se encuentran de forma nativa en la pulpa dental y estas condiciones nativas se pueden alterar cuando pasan a las condiciones de un medio de cultivo in vitro. Estas alteraciones pueden ser la respuesta a un proceso de adaptación. Dicha adaptación, junto con el estrés adicional generado por el tratamiento enzimático realizado para digerir la matriz extracelular, tiene como consecuencia una pérdida transitoria y leve de la viabilidad producida por un mecanismo de apoptosis. En resumen, los 3 primeros subcultivos de hDPSC deberán ser descartados para su uso en ingeniería tisular, por ser células en un estado de apoptosis activa.

Introduction: The development of biological substitutes by Tissue Engineering needs the use of a stem cell source able not only to self-replicate and differentiate, but also to maintain optimal functionality and cell viability when used. The evaluation of cell viability is considered an important quality control, especially in cell lineages with high capabilities for being used in tissue engineering, as dental pulp stem cells (DPSC). The aim of this research is to evaluate the cell viability through three human dental pulp stem cells (hDPSC) subcultures. Materials and methodology:Three consecutive hDPSC subcultures were obtained from human sound third molars (N = 3) by enzymatic digestion. Intracellular ionic concentration of sodium (Na), potassium (K) and chlorine (Cl) was determined by electron probe X-ray microanalysis (EPXMA). Apoptotic cells percentage (DNA fragmentation) was determined by TUNEL fluorescence assay at first and third subculture Results: A significant decrease of potassium was detected at second subculture (p = 0,011), suggesting a loss of cell viability. At third subculture, chlorine and sodium statistically increased (p = 0,010 y p = 0,002), inducing an apoptotic-like ionic profile. Fluorescence from TUNEL assay revealed 2,76 ± 1,80 % of apoptotic cells at third subculture, while that ratio was 0,55 ± 0,27% at first subculture. Discussion: hDPSC are natively stored in the dental pulp and these native conditions may be altered by the in vitro cell culture conditions. In this regard, these alterations could be in response to an adaptative process. This adaptative process, besides cell stress as a consequence of an enzymatic treatment for the extracellular matrix digestion, produces a mild and temporary loss of cell viability by apoptosis. In summary, the first, second and third subculture of hDPSC should be discarded for the use in tissue engineering as they are apoptotic.