La energética de la desnaturalización de proteínas inducida por guanidina y urea : relación con las contribuciones electrostáticas a la estabilidad

Abstract

En este trabajo se aborda el problema metodológico de la determinación experimental de valores del cambio de energía de Gibbs de desnaturalización, a partir de perfiles de desplegamiento inducido por codisolventes, así como la interpretación molecular de estos valores. Para ello, caracterizamos el desplegamiento inducido por guanidina de lisozima de clara de huevo en el rango de temperatura de 30-75 grados C, mediante diferentes procedimientos experimentales: medidas de fluorescencia de muestras en equilibrio, ensayos de desplegamiento, medidas cinéticas y calorimetría diferencial de barrido. El análisis de los diferentes perfiles de desplegamiento mediante el método de extrapolación lineal (LEM) conduce a valores del cambio de energía de Gibbs en disolución acuosa unos 15 kJ/mol menores a los obtenidos por calorimetría diferencial de barrido. Esta discrepancia nos llevó a proponer un nuevo método de extrapolación para la determinación de energías de Gibbs de desplegamiento en ausencia de desnaturalizante, a partir de datos de desnaturalización por disolvente (procedimiento de extrapolación a G constante). Por otra parte, hemos sugerido una interpretación plausible de las desviaciones de la linealidad en el perfil de cambio de energía de Gibbs en disolución acuosa versus concentración de desnaturalizante en términos de las contribuciones debidas a interacciones electrostáticas a la estabilidad de la proteína. Para explorar esta hipótesis hemos estudiado el desplegamiento de ubiquitina (bovina y de levadura) inducido por guanidina en función del pH. Nuestra hipótesis acerca de la estimación de la contribución debida a las interacciones entre cargas se ve confirmada con los cálculos teóricos realizados con el programa TITRA. En la última parte del trabajo se hace un estudio de una de las suposiciones extratermodinámicas que generalmente se utilizan en el análisis de datos de desnaturalización con disolventes: el modelo de desplegamiento de dos estados. Para ello hemos caracterizado el desplegamiento inducido por urea de lisozima en las mismas condiciones dadas por Chen, L. Hodgson, K. O. y Doniach, S. (1996) J. Mol. Biol. 261, 658-671, trabajo en el que se sugiere la presencia de un estado intermedio de equilibrio significativamente poblado