Rnas inhibidores frente al virus de la inmunodeficiencia humana

Abstract

En la presente tesis se describe la generación de pequeñas moléculas de RNA con función inhibidora frente al Virus de la Inmunodeficiencia Humana de Tipo 1 (VIH-1). Este virus es el agente causal del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida y perteneciente al género Lentivirus de la familia Retroviridae. El virus presenta una alternancia en cuanto al tipo de material genético en su ciclo de vida, siendo RNA en las partículas virales y DNA en el provirus (durante la fase de latencia o en el proceso replicativo intracelular). La alta variabilidad genética del virus hace que sólo una terapia combinada de fármacos consiga reducir eficazmente la carga viral a costa de severos efectos secundarios en los estadíos avanzados del tratamiento y no llegando nunca a curar la enfermedad. Esto justifica la necesidad de desarrollar nuevos fármacos y estrategias que sean más efectivas y dificulten la aparición de resistencias, estando la intervención directa sobre el genoma viral de RNA entre ellas. El RNA es un tipo de material genético altamente versátil. Se postula que en los momentos iniciales de la evolución biológica, el RNA fue la materia de los primeros elementos replicativos. Como ácido nucleico, tiene capacidad de almacenar información genética, pero además está dotado de una habilidad intrínseca para ciertos aspectos funcionales como la unión de moléculas o la catálisis. Hoy en día se han descrito múltiples ejemplos de moléculas de RNA funcionales vestigio de aquella época e implicadas en procesos biológicos centrales, como son los RNAs antisense naturales, los RNAs catalíticos (ribozimas), los microRNAs y los riboswitches. La ingeniería molecular ha desarrollado técnicas para conseguir de forma artificial RNAs funcionales, como ribozimas o aptámeros (moléculas capaces de unir ligandos específicos). Estas técnicas reciben el nombre genérico de Selección Molecular In Vitro, si bien los destinados a la generación de aptámeros se denominan preferentemente Evolución Sistemática de Ligandos por Enriquecimiento Exponencial o SELEX. Los virus de RNA son agentes infecciosos que han sufrido una fuerte presión selectiva para la reducción del tamaño de sus genomas y se especula que su origen se remonta a los primeros estadíos de la vida tal como hoy la conocemos. Reflejo de ello sería la alta densidad de elementos funcionales de RNA en sus genomas que suponen un ahorro en espacio respecto a la codificación de proteínas. La región 5' no traducible (5'UTR) del RNA del VIH-1 es rica en dominios de este tipo implicados en procesos como transcripción, retrotranscripción, traducción, dimerización del genoma viral, splicing, empaquetamiento del virión, etc. y la base de la funcionalidad de cada uno radica en interacciones específicas RNA-RNA y RNA-proteínas similares a las descritas en las especies naturales anteriormente mencionadas. El alto grado de conservación de los dominios de la 5'UTR del VIH-1 indica que son esenciales para el virus, y la base de su actividad les predispone para ser diana de RNAs terapéuticos como aptámeros, ribozimas o decoys (moléculas artificiales que mimetizan ligandos y compiten por la unión a factores específicos) para interferir con su actividad biológica. El dominio DIS de la 5'UTR del VIH-1 es un elemento de RNA con plegamiento tipo horquilla y con un palíndromo de secuencia en su lazo apical. Esto le habilita para interaccionar con otras moléculas DIS y formar un kissing complex responsable de iniciar la dimerización de las dos moléculas de RNA genómico viral presentes en cada virión. En este estudio se han diseñado moléculas de RNA antisense y decoy frente al dominio DIS que interfieren con su capacidad de dimerización al competir con las moléculas DIS naturales. Estas moléculas han sido combinadas con ribozimas de tipo hairpin y hammerhead diseñadas previamente para catalizar el corte en trans de la molécula de RNA de la 5'UTR del VIH-1. El resultado ha sido moléculas de RNA quiméricas con capacidad para unirse al dominio DIS y cortar el RNA del VIH-1 en su región 5'UTR, denominadas RNAs antisense catalíticos. En otra línea de trabajo, se ha utilizado la técnica SELEX para obtener aptámeros de RNA específicos para unirse a la región 5'UTR común a todos los RNAs virales (genómico y subgenómicos). Se ha determinado el efecto que tiene sobre la estructura de la 5'UTR del VIH-1, la unión in vitro de un grupo seleccionado de aptámeros. Estos datos han sido utilizados para predecir el o los puntos de unión de cada aptámero a la molécula. Tanto RNAs antisense catalíticos como aptámeros han sido probados como inhibidores ex vivo de la formación de partículas virales en ensayos de transfección de cultivos de la línea celular HEK293T. Para ello se han utilizado tanto RNAs inhibidores sintetizados in vitro como construcciones plasmídicas de expresión de dichos inhibidores. En ambos casos, los RNAs inhibidores fueron conjugados con las horquillas 5' y 3' del snRNA U6 para dotarles de estabilidad y localización nuclear. Algunas de estas moléculas han alcanzado inhibiciones en torno al 80%. Los aptámeros de RNA presintetizados in vitro también han sido probados para la inhibición de la replicación viral ex vivo en ensayos de infección de cultivos de la línea celular Jurkat, resultando eficaces aquellos que se unen a la burbuja lateral del dominio TAR o interfieren con su plegamiento. El estudio del efecto de los RNAs antisense catalíticos sobre la dimerización de la 5'UTR ha proporcionado, además, datos que han permitido elaborar un modelo sobre este proceso. Este modelo integra la existencia de dos confórmeros monoméricos de la molécula, denominados ramificado en múltiples horquillas (BMH) y con interacciones a larga distancia (LDI), y el hecho de que solo uno de ellos es capaz de alcanzar el estado dimérico. Finalmente, se ha realizado un análisis bioinformático de las poblaciones de RNA de las diferentes rondas de SELEX y se ha identificado un motivo estructural y de secuencia común a las moléculas de los últimos ciclos de selección. Un estudio predictivo de unión ha permitido depurar el punto de unión del mismo: el lazo apical del dominio Poly-A de la 5'UTR del VIH-1. Se han diseñado dos moléculas de RNA artificiales de 16 nt de longitud denominadas RNA16(+) y RNA16(-), de modo que ambas conservan la estructura in silico del motivo y sólo la primera conserva la secuencia. Se probó que RNA16(+) es capaz de unirse a la 5'UTR in vitro mientras que RNA16(-) no, y coincidentemente se obtuvo una inhibición significativa de la producción de partículas virales ex vivo en ensayos de transfección de cultivos de la línea celular HEK293T por RNA16(+) en comparación con RNA16(-). Concluimos así que esta estrategia bioinformática permite evitar el procedimiento empírico de ensayo y error de variantes aptaméricas truncadas arbitrariamente para la obtención de aptámeros funcionales de pequeño tamaño, suponiendo una notable mejora de la técnica actual.