Validación de ensayos moleculares para diagnóstico de leishmaniasis cutánea

Abstract

La leishmaniasis es una enfermedad parasitaria con un amplio y complejo espectro clínico que supone un desafío significativo para la salud pública mundial. Para realizar un diagnóstico certero, establecer un pronóstico adecuado y seleccionar el tratamiento más efectivo, es fundamental identificar las especies de Leishmania con precisión. No obstante, los métodos moleculares convencionales, si bien son sensibles, suelen ser costosos, laboriosos y no siempre permiten diferenciar de manera inequívoca entre especies, por lo que limitan su implementación en entornos con infraestructura y recursos limitados. Esta tesis doctoral aborda esta demanda diagnóstica y se centra en el desarrollo de herramientas innovadoras que permitan detectar e identificar las especies de Leishmania de manera sencilla, rápida y asequible. Para ello, se ha explorado y aplicado la tecnología de Química Dinámica para la Detección de Ácidos Nucleicos (DCL, Dynamic Chemistry Labelling). El objetivo principal de esta tesis fue implementar y validar plataformas diagnósticas complementarias basadas en esta tecnología, destinadas a la detección de Leishmania spp. en muestras de pacientes con leishmaniasis cutánea y a la diferenciación entre sus especies. En el marco de este trabajo, se usaron sondas químicas optimizadas para el reconocimiento de marcadores genéticos específicos del gen hsp70, que es crucial para identificar las especies de Leishmania. Se desarrolló con éxito una primera plataforma diagnóstica en formato spin-tube colorimétrico. Esta modalidad demostró ser muy robusta, con una alta sensibilidad de detección y una especificidad excepcional. La plataforma permitió diferenciar con precisión y rapidez especies clínicamente relevantes como L. braziliensis, L. guyanensis y L. panamensis, responsables de la leishmaniasis cutánea y mucocutánea. Su simplicidad de uso, bajo coste y la visualización directa del resultado, sin requerir equipos especializados, la posicionan como una solución diagnóstica ideal para áreas endémicas con recursos limitados. Paralelamente, se exploró una segunda plataforma diagnóstica basada en fluorescencia, concretamente, para el análisis por citometría de flujo. Aunque la citometría de flujo no permitió una identificación precisa en las condiciones experimentales analizadas, se adaptó la metodología para lectura con un lector de placas. Esta estrategia alternativa demostró una mayor sensibilidad y una cuantificación fiable, por lo que es adecuada para su integración en laboratorios clínicos hospitalarios con infraestructura establecida. La validación de ambas plataformas se realizó mediante el análisis de una cohorte de 69 muestras clínicas de pacientes con sospecha de leishmaniasis cutánea procedentes de Santo Domingo de los Tsáchilas (Ecuador). Se llevó a cabo inicialmente un estudio clínico-epidemiológico de la población objeto de estudio. Por otro lado, dichas muestras de pacientes fueron diagnosticadas empleando técnicas diagnósticas convencionales (frotis, PCR y secuenciación) y los resultados obtenidos se compararon con los obtenidos mediante DCL, lo que confirmó la solidez, reproducibilidad y aplicabilidad del ensayo. Se logró la diferenciación de especies al verificar la presencia de secuencias específicas, incluida la presencia del nucleótido «G» en las tres posiciones SNF del gen hsp70, lo que demuestra la capacidad del método para distinguir entre las especies causantes de leishmaniasis cutánea y mucocutánea. En resumen, la tecnología DCL, en particular la plataforma spin-tube colorimétrica, emerge como una herramienta diagnóstica valiosa para el diagnóstico clínico de la leishmaniasis cutánea.

Leishmaniasis is a parasitic disease with a diverse and complex clinical spectrum that poses a significant global public health challenge. Accurate identification of Leishmania species is essential for a precise diagnosis, an appropriate prognosis and the selection of an effective treatment. However, while conventional molecular diagnostic methods are sensitive, they are often costly and labour-intensive, and may not always allow for unequivocal species differentiation. This limits their implementation in settings with constrained infrastructure and resources. This doctoral thesis addresses this diagnostic gap by focusing on developing innovative tools that can simultaneously detect and identify Leishmania species quickly and easily. To this end, Dynamic Chemistry Labelling (DCL) technology for nucleic acid detection has been explored and applied. This thesis aimed to implement and validate complementary DCL-based diagnostic platforms designed to detect Leishmania spp. in samples from patients with cutaneous leishmaniasis and differentiate between species. During this study, DCL chemical probes were used to recognise specific genetic markers within the HSP70 gene, which is crucial for identifying Leishmania species. The first diagnostic platform was successfully developed in a colourimetric spin-tube format. This format demonstrated remarkable robustness, offering high detection sensitivity and exceptional specificity. The platform enables the early and precise differentiation of clinically relevant species, such as L. braziliensis, L. guyanensis and L. panamensis, which are responsible for cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Its ease of use, low cost and direct result visualisation, which does not require specialised equipment, makes it an ideal diagnostic solution for endemic areas with limited resources. Next, a fluorescence based diagnostic platform, initially using flow cytometry, was explored. While flow cytometry did not permit precise identification under the investigated experimental conditions, the methodology was adapted for use with a plate reader. This alternative strategy provided enhanced sensitivity and reliable quantification, proving suitable for integration into established hospital laboratory settings. Both platforms were validated by analysing a cohort of 69 clinical samples from patients with suspected cutaneous leishmaniasis, which were collected in Santo Domingo de los Tsáchilas in Ecuador. A clinical-epidemiological study of the population was initially carried out. In addition, these patient samples were diagnosed using conventional diagnostic techniques (smear, PCR and sequencing) and the results obtained were compared with those obtained by DCL, confirming the robustness, reproducibility and applicability of the assay. Species differentiation was achieved by verifying the presence of specific sequences, including the 'G' nucleotide at three SNF positions within the hsp70 gene. This demonstrates the method's capability to distinguish between the species that cause cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. In summary, DCL technology, particularly the colourimetric spin-tube platform, is a valuable tool for diagnosing cutaneous leishmaniasis clinically.