Differences in the secretion pattern of oxidoreductases from Bjerkandera adusta induced by a phenolic olive mill extract

Abstract

The secretome of the white-rot fungus Bjerkandera adusta produced in synthetic Kirk medium was compared to that supplemented with an aqueous phenol-rich extract of dry olive mill residues (ADOR). Distinct changes in the protein composition of oxidoreductases, namely diverse class-II peroxidases and aryl alcohol oxidases were found. In the ADOR-supplemented medium (ASC), 157 distinct proteins were identified by the secretome analysis, whereas only 59 of them were identified without ADOR supplementation (Kirk medium culture; KM). Proteome analysis indicated that the number of peroxidases produced in ASC was more than doubled (from 4 to 11) compared to KM. Two short manganese peroxidases (MnP1 and MnP6) and one versatile peroxidase (VP1) represented 29% of the relative abundance (NSAF) in ASC. Two of them (MnP1 and VP1) were also detected in KM at a relative abundance (NSAF) of only 3%. Further peroxidases present in ASC were one lignin peroxidase (LiP2), one generic peroxidase (GP) and three dye-decolorizing peroxidases (DyPs). The relative abundance of DyPs and aryl alcohol oxidases (AAO) were lower in ASC in comparison to KM. In addition to peptide sequence analysis, the secretion of Mn2+-oxidizing peroxidases as well as AAOs were followed by enzyme measurement. The Mn2+-oxidizing activity increased nearly 30-fold (from 10 to 281 U l−1) after ADOR addition. Two enzymes responsible for that activity were successfully purified (BadVPI and BadVPII). To prove a potential involvement of these enzymes in the degradation of aromatic compounds, BadVPI was tested for its ability to degrade the recalcitrant dehydrogenated polymer (DHP, synthetic lignin). These results show that natural phenol-rich materials act as secretome-stimulating additives. Applying these substances enables us to investigate fungal degradation and detoxification processes and gives more insight into the complexity of fungal secretomes, e.g. of white-rot fungi.

El secretoma del hongo de podredumbre blanca Bjerkandera adusta producido en medio sintético de Kirk se comparó con el obtenido en el mismo medio suplementado con un extracto acuoso rico en fenoles procedente de residuos secos de la producción de aceite de oliva (ADOR). Se encontraron cambios significativos en la composición proteica de las oxidorreductasas, concretamente en diversas peroxidasas de clase II y en alcohol oxidasas aromáticas. En el medio suplementado con ADOR (ASC), el análisis del secretoma permitió identificar 157 proteínas distintas, mientras que sin la suplementación con ADOR (cultivo en medio Kirk; KM) solo se identificaron 59. El análisis proteómico indicó que el número de peroxidasas producidas en ASC se duplicó con creces (de 4 a 11) en comparación con KM. Dos peroxidasas cortas de manganeso (MnP1 y MnP6) y una peroxidasa versátil (VP1) representaron el 29 % de la abundancia relativa (NSAF) en ASC. Dos de ellas (MnP1 y VP1) también se detectaron en KM, pero con una abundancia relativa (NSAF) de solo el 3 %. Otras peroxidasas presentes en ASC fueron una lignina peroxidasa (LiP2), una peroxidasa genérica (GP) y tres peroxidasas decolorantes de colorantes (DyPs). La abundancia relativa de las DyPs y de las alcohol oxidasas aromáticas (AAO) fue menor en ASC en comparación con KM. Además del análisis de secuencias peptídicas, la secreción de peroxidasas oxidantes de Mn²⁺ y de AAOs se evaluó mediante mediciones enzimáticas. La actividad oxidante de Mn²⁺ aumentó casi 30 veces (de 10 a 281 U l⁻¹) tras la adición de ADOR. Dos enzimas responsables de dicha actividad fueron purificadas con éxito (BadVPI y BadVPII). Para demostrar una posible implicación de estas enzimas en la degradación de compuestos aromáticos, BadVPI se evaluó en cuanto a su capacidad para degradar el polímero deshidrogenado recalcitrante (DHP, lignina sintética). Estos resultados muestran que los materiales naturales ricos en fenoles actúan como aditivos estimuladores del secretoma. La aplicación de estas sustancias permite investigar los procesos fúngicos de degradación y detoxificación y aporta una mayor comprensión de la complejidad de los secretomas fúngicos, como los de los hongos de podredumbre blanca.