Hacia el desarrollo de antivirales de amplio espectro: identificación y caracterización de inhibidores de la gemación vírica

Abstract

Las infecciones virales son una de las principales causas de enfermedad a nivel mundial. Los tratamientos actuales, escasos para la gran variedad de virus que pueden afectar a los seres humanos, se centran en la inactivación directa de las proteínas víricas, propiciando la aparición de resistencias. Este contexto evidencia la necesidad de desarrollar nuevos antivirales. Los virus requieren el secuestro de diferentes proteínas de las células hospedadoras para su proliferación. En muchos casos, este proceso se media por interacciones con secuencias peptídicas cortas de las proteínas del virus. El bloqueo de estas interacciones dirigido a las proteínas del hospedador se considera una estrategia atractiva para el desarrollo de antivirales de amplio espectro con menor tendencia al desarrollo de cepas resistentes. El mecanismo de egresión celular de muchos virus de distintas familias se basa en la interacción de los dominios L de secuencia P(T/S)AP y LYP(X)nL con los dominios UEV de la proteína humana TSG101 y V de la proteína humana ALIX, respectivamente. Por otra parte, el extremo C terminal de la proteína E de los coronavirus se une al dominio PDZ de PALS1 y lo desplaza del complejo apical de polaridad celular, perturbando las uniones estrechas para permitir la entrada del virus a través de tejidos epiteliales. El trabajo desarrollado en esta Tesis se centra en confirmar la posibilidad de bloquear estas interacciones entre dominios proteicos y secuencias peptídicas virales con moléculas pequeñas con propiedades aptas para el desarrollo de fármacos. Adicionalmente, se explora si esta inhibición también se produce entre las proteínas humanas y virales completas, así como el efecto fenotípico sobre la proliferación viral, con un enfoque multidisciplinar que confirma el mecanismo de acción de los candidatos a fármacos seleccionados. Se han llevado a cabo una serie de campañas de cribado de alto rendimiento miniaturizadas basadas en medidas de estabilidad térmica y ensayos de competición que han permitido la identificación de ligandos que se unen selectivamente a los dominios diana, bloqueando sus interacciones con las secuencias peptídicas virales con IC50s en el rango micromolar bajo. Una serie de ensayos celulares de actividad que incluyen ensayos de alto contenido de complementación bimolecular, medidas de producción de virus-like particles y actividad antiviral frente a virus completos se han utilizado para confirmar la capacidad de los compuestos de alcanzar y regular sus dianas en un entorno celular y su efecto sobre la gemación vírica. Asimismo, a partir de este flujo de trabajo se han desarrollado metodologías para la exploración de mayores espacios químicos mediante cribado de colecciones de extractos naturales y cribado virtual entrenado por Machine Learning. Los inhibidores identificados constituyen puntos de partida prometedores para el desarrollo de nuevos antivirales de amplio espectro y herramientas valiosas para la investigación de los mecanismos de gemación y virulencia de diferentes virus, y para evaluar los posibles efectos secundarios que pueden inducir el bloqueo de las interacciones de los dominios diana.

Viral infections are among the leading causes of disease worldwide. Current treatments, which are limited given the vast diversity of viruses capable of infecting humans, primarily target the direct inactivation of viral proteins, thereby facilitating the emergence of resistant strains. This context highlights the urgent need to develop new antiviral agents. Viruses rely on hijacking various host cell proteins to support their life cycle. In many cases, this process is mediated by interactions with short peptide sequences derived from viral proteins. Targeting these interactions at the host protein level is considered an attractive strategy for the development of broad-spectrum antivirals with a reduced propensity for resistance development. The egress mechanism of many viruses from diverse families depends on the interaction between L-domains containing P(T/S)AP and LYP(X)nL motifs with the UEV domain of human TSG101 and the V domain of the human protein ALIX, respectively. Additionally, the C-terminus of the coronavirus E protein binds to the PDZ domain of PALS1, displacing it from the apical polarity complex and disrupting tight junctions to facilitate viral entry through epithelial tissues. This thesis focuses on validating the feasibility of disrupting these interactions between protein domains and viral peptide sequences using small molecules with drug-like properties. Furthermore, it investigates whether such inhibition also occurs between full-length human and viral proteins and examines the phenotypic effects on viral replication through a multidisciplinary approach that confirms the mechanisms of action of selected drug candidates. A series of miniaturized high-throughput screening campaigns, based on thermal stability measurements and competition-based binding assays, enabled the identification of ligands that selectively bind to target domains, effectively blocking their interactions with viral peptide sequences with low micromolar IC₅₀ values. Cellular activity assays, including high-content bimolecular complementation assays, virus-like particle production assays, and antiviral assays against complete viruses, were employed to confirm the compounds’ ability to reach and modulate their targets in a cellular context and to evaluate their effects on viral budding and replication. Additionally, this workflow facilitated the development of methodologies to explore broader chemical spaces through the screening of natural product libraries and machine learning-guided virtual screening. The identified inhibitors represent promising starting points for the development of novel broad-spectrum antivirals. They also serve as valuable tools for investigating the mechanisms underlying viral budding and virulence across different viruses and for evaluating potential side effects associated with the disruption of the target domain interactions.