Evaluación de los mecanismos de sarcopenia en el modelo de ratón knockout para Bmal1 (iMS-Bmal1-/-)

Abstract

El envejecimiento conlleva un deterioro progresivo en la funcionalidad de los organismos, aumentando el riesgo de enfermedades crónicas. En este contexto, la sarcopenia es una enfermedad asociada al envejecimiento que se caracteriza por la pérdida gradual de masa muscular, fuerza y función, lo que compromete la movilidad, la salud general y la esperanza de vida. Aunque sus mecanismos subyacentes no están completamente esclarecidos, se han identificado varios factores implicados en su desarrollo, como la inflamación crónica, el estrés oxidativo, la disfunción mitocondrial, la apoptosis y cambios hormonales y microvasculares, todos los cuales afectan la homeostasis del músculo esquelético. Cada vez hay más pruebas que vinculan la cronodisrupción con el envejecimiento, lo que sugiere que las alteraciones en los ritmos circadianos podrían contribuir al desarrollo de la sarcopenia. Los genes y proteínas del reloj circadiano se expresan en el músculo esquelético, y entre ellos destaca Bmal1, un gen clave que vincula el reloj biológico con el sistema inmunitario y desempeña funciones esenciales en la salud muscular. Bmal1 regula procesos fundamentales como la reparación muscular y la función mitocondrial. Dado que su expresión disminuye con la edad, la alteración del reloj circadiano en el músculo esquelético podría estar estrechamente relacionada con la sarcopenia. Para investigar esta hipótesis, desarrollamos un modelo de ratón deficiente para Bmal1 inducible y específico de músculo esquelético (iMSBmal1−/−), con el objetivo de evaluar si la pérdida de este gen contribuye a los cambios que conducen a la sarcopenia. Los ratones iMS-Bmal1−/− mostraron una disminución en la actividad locomotora y alteraciones en los ritmos circadianos, junto con una reducción de la masa muscular y un aumento en la fragilidad. Además, se observó atrofia, fibrosis y una conversión hacia fibras musculares más oxidativas. Estos cambios se acompañaron de una disminución en la capacidad oxidativa mitocondrial, lo que sugería una adaptación compensatoria en el metabolismo de las fibras musculares. También se observaron alteraciones en la ultraestructura muscular, con mayor daño mitocondrial y reducción en el número de mitocondrias. Para contrarrestar estos efectos, evaluamos el impacto terapéutico del ejercicio físico y la melatonina. Ambos tratamientos mitigaron las consecuencias negativas de la pérdida de Bmal1, destacando la importancia de este gen en la salud muscular, y demostraron que tanto el ejercicio como la melatonina son estrategias efectivas contra la sarcopenia, incluso en ausencia de Bmal1. Basándonos en estos hallazgos, el presente estudio profundiza en los mecanismos moleculares que subyacen a estos cambios y en las vías a través de las cuales la melatonina y el ejercicio ejercen sus efectos beneficiosos. Para ello, analizamos la expresión de marcadores de células madre musculares (MuSC) y de factores reguladores de la miogénesis muscular (MRFs), así como alteraciones en la morfología muscular mediante resonancia magnética nuclear (RMN). Para conocer el estado mitocondrial en el modelo experimental, se evaluó la tasa de consumo de oxígeno (OCR), fuga de protones y producción de ATP, mediante experimentos con mitocondrias aisladas en Seahorse. Adicionalmente, se analizaron proteínas y genes relacionados con la dinámica mitocondrial en los procesos de fusión, fisión, biogénesis mitocondrial y mitofagia, así como cambios en la vía NAMPT-NAD+-SIRTs y otros marcadores asociados a la inflamación y la señalización Klotho-FGF21, mediante técnicas de Western blot y qRT-PCR. Finalmente, se midió el cociente NAD+/NADH en los distintos grupos, incluyendo los animales control y los tratados con ejercicio y/o melatonina. Los resultados indican que los ratones iMS-Bmal1−/− presentan una menor expresión en los marcadores de MuSC y MRFs, lo que sugiere una regeneración muscular alterada en los animales con deficiencia en Bmal1, que fue restaurada con los tratamientos de ejercicio y/o melatonina. Aunque la respiración mitocondrial no mostró cambios significativos, el ejercicio produjo una disminución en el valor de OCR, que la melatonina no logró contrarrestar. Al contrario, la inhibición del complejo I (CI) con rotenona disminuyó la OCR, lo que podría indicar una alteración a nivel del complejo II (CII) en este modelo de ratón. Además, se observaron mejoras en la fuga de protones y la producción de ATP en los grupos con tratamientos compensando la deficiencia mitocondrial. También se observaron alteraciones en la dinámica mitocondrial que afectaron la integridad de las mitocondrias en el músculo esquelético, dando explicación a los cambios en la morfología que se produce con la falta de Bmal1. Además, estos ratones mostraron alteraciones en el metabolismo energético, una respuesta antioxidante deteriorada y un perfil inflamatorio alterado. De manera destacable, tanto el ejercicio como la melatonina lograron revertir estos déficits, restaurando la salud muscular en ausencia de Bmal1 y dando explicación de los cambios que observamos que desencadenan sarcopenia. Estos hallazgos refuerzan la importancia del reloj circadiano en la homeostasis del músculo esquelético y posicionan al ejercicio y la melatonina como estrategias terapéuticas prometedoras contra la sarcopenia. Además, resaltan la necesidad de profundizar en las vías moleculares responsables de sus efectos protectores, lo que podría abrir nuevas oportunidades para el desarrollo de intervenciones dirigidas a mitigar el impacto del envejecimiento en la musculatura esquelética.

Aging entails a progressive deterioration in the functionality of organisms, increasing the risk of chronic diseases. In this context, sarcopenia is an aging-associated disease characterized by the gradual loss of muscle mass, strength, and function, which affects mobility, overall health, and life expectancy. Although its underlying mechanisms are not fully elucidated, several factors involved in its development have been identified, such as chronic inflammation, oxidative stress, mitochondrial dysfunction, apoptosis, and hormonal and microvascular changes, all of which affect skeletal muscle homeostasis. There is increasing evidence supporting the relationship between chronodisruption and aging, suggesting that alterations in circadian rhythms could contribute to the development of sarcopenia. Circadian clock genes and proteins are expressed in skeletal muscle, among which Bmal1 stands out as a key gene that links the biological clock with the immune system and plays essential roles in muscle health. Bmal1 regulates fundamental processes such as muscle repair and mitochondrial function. Since its expression decreases with age, circadian clock disruption in skeletal muscle could be closely related to sarcopenia. To investigate this hypothesis, we developed an inducible and muscle-specific Bmal1 knockout mouse model (iMS-Bmal1−/−) to determine whether the loss of this gene could be a key factor in the changes leading to sarcopenia. iMS-Bmal1−/− mice showed a decrease in locomotor activity and alterations in circadian rhythms. Additionally, they exhibited a reduction in muscle mass and an increase in frailty. Structurally, muscle atrophy, fibrosis, and a shift toward more oxidative muscle fibers were observed. These changes were accompanied by a decrease in mitochondrial oxidative capacity, suggesting a compensatory adaptation in muscle fiber metabolism. Alterations in muscle ultrastructure were also evident, with increased mitochondrial damage and a reduction in the number of mitochondria. To counteract these effects, we evaluated the therapeutic impact of physical exercise and melatonin. Both treatments mitigated the negative consequences of Bmal1 loss, highlighting the importance of this gene in muscle health, and demonstrated that both exercise and melatonin are effective strategies against sarcopenia, even in the absence of Bmal1. Based on these findings, the present study delves into the molecular mechanisms underlying these changes and the pathways through which melatonin and exercise exert their beneficial effects. For this purpose, we analyzed the expression of muscle stem cell (MuSC) markers and myogenic regulatory factors (MRFs) as well as alterations in muscle morphology using nuclear magnetic resonance (RMN). To determine the mitochondrial state in the experimental model, we assessed oxygen consumption rate (OCR), proton leak, and ATP production using isolated mitochondria in Seahorse assays across different experimental groups. Additionally, proteins and genes related to mitochondrial dynamics in the processes of fusion, fission, mitochondrial biogenesis, and mitophagy were analyzed, along with changes in the NAMPT-NAD+-SIRTs pathway and other markers associated with inflammation and Klotho-FGF21 signaling using Western blot and qRT-PCR techniques. Finally, the NAD+/NADH ratio was measured in the different groups, including control animals and those treated with exercise and/or melatonin. The results indicate that iMS-Bmal1−/− mice showed lower expression of MuSC and MRF markers, suggesting impaired muscle regeneration in Bmal1-deficient animals, which was restored with exercise and/or melatonin treatments. Although mitochondrial respiration did not show significant changes, exercise led to a decrease in OCR, which melatonin failed to counteract. On the contrary, complex I (CI) inhibition with rotenone decreased OCR, which could indicate an alteration at the complex II (CII) level in this mouse model. Additionally, improvements in proton leak and ATP production were observed in the treatment groups, compensating for mitochondrial deficiency. Alterations in mitochondrial dynamics were also evident, affecting mitochondrial integrity in skeletal muscle and explaining the morphological changes caused by Bmal1 deficiency. Furthermore, these mice exhibited alterations in energy metabolism, a deteriorated antioxidant response, and an altered inflammatory profile. Notably, both exercise and melatonin successfully reversed these deficits, restoring muscle health in the absence of Bmal1 and providing an explanation for the changes that trigger sarcopenia. These findings reinforce the importance of the circadian clock in skeletal muscle homeostasis and position exercise and melatonin as promising therapeutic strategies against sarcopenia. Moreover, they highlight the need to further investigate the molecular pathways responsible for their protective effects, which could open new opportunities for developing interventions aimed at mitigating the impact of aging on skeletal muscle.