Diagnóstico molecular de la vaginitis: Desarrollo y validación de un test de PCR a tiempo real para la identificación de los principales agentes causantes de vaginitis infecciosa

Abstract

La microbiota vaginal desempeña un papel fundamental en la salud ginecológica al actuar como barrera protectora frente a infecciones. Las alteraciones en este ecosistema pueden derivar en afecciones como la vaginosis bacteriana (VB), la vulvovaginitis candidiásica (VVC) y la tricomoniasis, que representan las principales causas de vaginitis infecciosa. Estas condiciones no solo impactan significativamente la calidad de vida de las pacientes, sino que también se asocian con complicaciones obstétricas y un mayor riesgo de contraer infecciones de transmisión sexual (ITS). Este trabajo presenta el diseño, desarrollo y validación de un test molecular basado en la técnica de PCR en tiempo real para el diagnóstico de las principales causas de vaginitis. El test diseñado permite la detección simultánea, mediante un formato de PCR multiplex, de los microorganismos que forman parte de la microbiota, Lactobacillus spp. (L. crispatus, L. jensenii, L. iners y L. gasseri), y los patógenos clave involucrados en estas infecciones: Gardnerella vaginalis, Fannyhessea vaginae, Candida albicans, C. glabrata, C. albicans, C. krusei, Candida spp. (C. parapsilosis, C. tropicalis y C. dubliniensis) y Trichomonas vaginalis. Para el diseño del test, en base a bibliografía y alineamientos de genomas, se identificaron los microorganismos clínicamente relevantes y se seleccionaron dianas genéticas altamente conservadas para el diagnóstico. Se diseñaron oligonucleótidos y sondas TaqMan específicas para cada diana, optimizando las condiciones de reacción hasta alcanzar una sensibilidad y especificidad óptimas inicialmente en formato singleplex para posterior aplicación en formato multiplex. Durante el desarrollo del test, se evaluaron diversos reactivos de PCR y métodos de extracción. Se seleccionó el master mix, kit de extracción y protocolo de amplificación que generó el mejor rendimiento. Se desarrolló un algoritmo propio para el diagnóstico de VB, que pretende establecer una clasificación de la microbiota vaginal similar a la que proporciona el método de Nugent (gold standard) en base a la cantidad de Lactobacillus frente a la cantidad de G. vaginalis y F. vaginae presente en la muestra. Este algoritmo alcanzó un AUC de 0,950, con una sensibilidad del 93% y una especificidad del 90,4%. Para demostrar la validez científica y el desempeño analítico y clínico del método, se realizó una validación interna conforme a los criterios establecidos en el Reglamento (UE) 2017/746 para la comercialización de productos sanitarios de diagnóstico in vitro (IVD) en la Unión Europea (marcado CE). Esta validación incluyó el análisis del límite de detección, precisión, sensibilidad y especificidad diagnóstica, reactividad cruzada, inclusividad y estabilidad del método para su uso con muestras de exudado vaginal de origen humano. Además, se evaluó la integración del test con sistemas automatizados, como el MagXtract® 3200 System, y su compatibilidad con equipos de amplificación, como el CFX96™ Real-Time PCR Detection System y el Azure Cielo™ 6 Real-Time PCR System. Los resultados obtenidos del análisis de estos parámetros confirmaron el adecuado funcionamiento analítico y clínico del test. Una vez obtenida la certificación CE, se llevó a cabo una evaluación externa que incluyó la comparación con métodos de diagnóstico tradicionales y otros basados en técnicas de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT). El análisis del desempeño del test Vaginal Panel Realtime PCR kit frente a estos métodos demostró que ofrece un rendimiento clínico equiparable para el diagnóstico de VB, VVC y tricomoniasis. En conclusión, este trabajo describe el diseño, desarrollo y validación del test Vaginal Panel Realtime PCR Kit que representa un avance significativo en el diagnóstico de vaginitis, proporcionando una herramienta rápida, precisa y confiable para el manejo clínico. Su implementación en la práctica clínica permite mejorar la atención a las pacientes, reducir complicaciones y optimizar las estrategias terapéuticas.