Biofabrication of complex tumor microenvironments with application in precision oncology

Abstract

Cancer remains a significant global health challenge, ranking as the second leading cause of death in developed countries, with nearly 20 million cases diagnosed in 2022. Tumors are heterogeneous, composed of multiple cell populations that include cancer cells, stromal cells, and infiltrating immune cells, all embedded in an extracellular matrix (ECM) that provides a niche conducive to tumor development. This tumor microenvironment (TME) influences key processes such as cell signaling, transport, motility, metastasis, and immune responses, and it is shaped by genetic, epigenetic, and transcriptomic changes, as well as environmental factors. Cancer stem cells (CSCs), responsible for tumor initiation and progression, add complexity to the TME and represent a critical therapeutic target for improving treatment outcomes and reducing metastasis. Oncology research faces a significant challenge, with over 97% of antitumor drug candidates failing clinical trials due to tumor heterogeneity, lack of predictive biomarkers, CSC-mediated resistance, and the absence of preclinical models that accurately reflect the patient’s reality. Three-dimensional (3D) models, which incorporate tumor ECM, offer a promising alternative to traditional 2D models, better mimicking the complexity of the TME and enabling more accurate studies of cell behavior and therapeutic responses. This thesis focuses on developing ECM substitutes for different tumor types (head and neck squamous cell carcinoma [HNSCC], and breast cancer [BC]) to biofabricate preclinical tumor models that recapitulate the cellular and compositional heterogeneity of the TME. In the development of the HNSCC model, the approach was using a decellularized ECM (dECM) derived from fibroblasts (fdECM) combined with alginate and gelatin to form a 3D hydrogel. This model integrated CSCs from the Cal-27 cell line, along with stromal components like FBs and MSCs, to mimic the HNSCC TME. The fdECM preserved essential ECM components, including collagen, fibronectin, and laminin, contributing to the hydrogel’s ability to promote cell adhesion, maintain viability, and drive robust cell proliferation. The effects of melatonin were tested on the model, showing antiproliferative effects on HNSCC CSCs and a reduction in tumor invasion and migration markers. This model provided a valuable tool for precision oncology, closely mimicking the HNSCC TME. The final phase developed a 3D BC tumor model by adapting dECMs to specific tumor subtypes. Protocols were optimized to obtain decellularized human adipose matrices (hDAM) and dECMs from BC cell lines representing four molecular subtypes: Luminal A (MCF-7), Luminal B (BT474), HER2+ (SKBR3), and TNBC (MDA-MB-231). These matrices retained essential ECM components and showed subtype-specific differences in composition and structural properties. The matrices were used to generate tumor models that reflected the aggressiveness of each subtype. The models showed different patterns of cellular reorganization, ECM remodeling, and TME activation and their mechanical properties correlated with tumor aggressiveness. Additionally, the models were tested with patient-derived breast cancer organoids (BCOs) to study drug responses, revealing that the matrices enhanced differential drug resistance. In conclusion, the research highlights the importance of using multicellular ECMbased tumor models that replicate the complexity of the TME. These models not only reveal tumor type-specific differences but also provide valuable tools for understanding tumor behavior, improving drug screening, and advancing personalized cancer therapies.

El cáncer sigue siendo un importante desafío de salud global, ocupando el segundo lugar como causa principal de muerte en los países desarrollados, con cerca de 20 millones de casos diagnosticados en 2022. Los tumores son heterogéneos, compuestos por múltiples poblaciones celulares que incluyen células cancerosas, células estromales y células inmunitarias infiltrantes, todas embebidas en una matriz extracelular (ECM) que proporciona un nicho propicio para el desarrollo del tumor. Este microambiente tumoral (TME) influye en procesos clave como la señalización y motilidad celular, la metástasis y las respuestas inmunológicas, y está determinado por cambios genéticos, epigenéticos y transcriptómicos, así como por factores ambientales. Las células madre tumorales (CSCs), responsables de la iniciación y la progresión del tumor, añaden complejidad al TME y representan un objetivo terapéutico crítico para mejorar los resultados del tratamiento y reducir la metástasis. La investigación oncológica enfrenta un desafío importante, ya que más del 97% de los candidatos a fármacos antitumorales fracasan en ensayos clínicos debido a la heterogeneidad tumoral, la falta de biomarcadores predictivos, la resistencia mediada por CSCs y la ausencia de modelos preclínicos que reflejen con precisión la realidad de los pacientes. Los modelos tridimensionales (3D) que incorporan la ECM tumoral ofrecen una alternativa prometedora a los modelos tradicionales bidimensionales (2D), ya que imitan mejor la complejidad del TME y permiten estudios más precisos sobre el comportamiento celular y las respuestas terapéuticas. Esta tesis se centra en el desarrollo de sustitutos de la ECM para biofabricar modelos preclínicos de diferentes tipos de tumores (carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello [HNSCC] y cáncer de mama [BC]) con el objetivo de recapitular la heterogeneidad celular y composicional del TME. En el desarrollo del modelo de HNSCC, se utilizó una ECM descelularizada (dECM) derivada de fibroblastos (fdECM) combinada con alginato y gelatina para formar un hidrogel 3D. Este modelo integró CSCs de la línea celular Cal-27, junto con componentes estromales como FBs y MSCs, para imitar el TME de HNSCC. La fdECM conservó componentes esenciales de la ECM, como el colágeno, la fibronectina y la laminina, lo que contribuyó a la capacidad del hidrogel para promover la adhesión celular, mantener la viabilidad e impulsar una sólida proliferación celular. Se probaron los efectos de la melatonina en el modelo, mostrando efectos antiproliferativos sobre las CSCs de HNSCC y una reducción de los marcadores de invasión y migración tumoral. En la fase final se desarrolló un modelo tumoral 3D para el cáncer de mama (BC) adaptando las dECMs a subtipos tumorales específicos. Se optimizaron protocolos para obtener matriz de tejido adiposo descelularizada (hDAM) y dECMs de líneas celulares de BC que representan los cuatro subtipos moleculares del BC: Luminal A (MCF-7), Luminal B (BT474), HER2+ (SKBR3) y TNBC (MDA-MB-231). Estas matrices retuvieron componentes esenciales de la ECM y mostraron diferencias específicas de su subtipo molecular en composición y estructura. La inclusión de estas matrices en los modelos tumorales permitió reflejar la agresividad de cada subtipo. Los modelos promovieron diferentes patrones de reorganización celular, remodelado de la ECM y activación del TME, y sus propiedades mecánicas se correlacionaron con la agresividad tumoral. Además, los modelos su utilizaron para el cultivo de organoides de cáncer de mama derivados de pacientes (BCOs) para estudiar las respuestas a fármacos, revelando que las matrices promovieron diferencialmente la resistencia a los fármacos. En conclusión, la investigación resalta la importancia de utilizar modelos tumorales 3D multicelulares basados en la ECM que repliquen la complejidad y heterogeneidad del TME. Los modelos desarrollados en esta tesis revelaron diferencias específicas del tipo tumoral, mimetizando el desarrollo tumorogénico, y reflejaron respuestas farmacológicas más cercanas a las que se dan en los pacientes. De esta manera, no sólo constituyen herramientas valiosas para entender el comportamiento tumoral, si no que pueden ayudar a mejorar el cribado de fármacos y avanzar en terapias personalizadas contra el cáncer.