Drug repurposing study based on NDRG1 inhibition in three-dimensional models derived from patients with triple-negative breast cancer

Abstract

Triple-negative breast cancer (TNBC) is the most aggressive type of breast cancer exhibiting high rates of relapse, metastasis, and mortality. Despite recent therapeutic advancements for metastatic TNBC, there remains a critical need for novel biomarkers and targeted therapies to improve patient outcomes. N-Myc downstream regulated gene 1 (NDRG1) exhibits pleiotropic activity across various cancer types, including TNBC. However, its intrinsic mechanism of action remains incompletely understood. Building upon our previous research, which demonstrated elevated NDRG1 expression following aggressive TGF-β stimulation, we hypothesized that this pathway could mediate NDRG1's tumorigenic role in TNBC. Initially, we observed that enhanced levels of NDRG1 gene expression correlated with poorer survival in TNBC patients through analyses of two public databases: the Kaplan-Meier plotter and GOBO database. We corroborated these findings through immunohistochemical assessment of NDRG1 protein expression in a cohort of 83 TNBC patients. Consequently, we concluded that high NDRG1 expression was indicative of poor prognosis compared to lower expression. Subsequently, we investigated the modulation of TGF-β and NDRG1 activity. We elucidated that NDRG1 activity depends on TGF-β stimulation and the origin of tumor cells. In pleural-effusion-derived cells (MDA-MB-231, MDA-MB-436) NDRG1 inhibition upon TGF-β stimulation reduced migration, invasion, and Vimentin expression, whereas these effects were not observed in primarytumor- derived cell lines (SUM159, BT549). We also examined key oncogenic processes, including the maintenance of cancer stem cell (CSC) populations by flow cytometry. Notably, primary-tumor cells required extended TGF-β stimulation to enhance NDRG1-mediated aggressiveness. This suggests that post-metastasis, brief TGF-β exposure suffices to induce aggressive behavior. NDRG1 regulated ALDH1+ CSCs maintenance across all four cell lines, while CD44+/CD24low/– and side population CSCs were maintained only in primarytumor- derived cells. Considering these findings and the potential tumor-suppressive role of NDRG1 in some TNBC patients, we pursued an alternative approach to direct NDRG1 inhibition. To identify drugs that mimic the antitumor transcriptomic signature resulting from inhibition of TGF-β-induced NDRG1, we performed a Connectivity Map study. Drug repurposing has emerged as a promising, efficient approach to investigate new therapies, avoiding the long and costly process that de novo drugs imply. As we had observed that NDRG1 inhibition following TGF-β stimulation produced an antitumor signature, we selected three candidates that might resemble this gene expression, which was studied via RNA sequencing technique. Our signature-based approach led to the selection of efavirenz, ouabain, and vinburnine as repurposed drug candidates. To validate their efficacy, we performed subsequent evaluations. These compounds significantly impaired tumor cell proliferation, CSC populations, self-renewal capacity, clonogenic properties, and migratory abilities in attached TNBC cell lines. Furthermore, given the absence of assessment of the combination of repurposed drugs in cancer research, we also study the effects of pair-combinations of our candidates. Notably, efavirenz + ouabain (EO) demonstrated superior efficacy in reducing CSC phenotypic properties. Furthermore, we studied their effects on epithelial-mesenchymal transition (EMT) markers by immunoblot and observed that they reduced Snail and Slug protein expressions. Importantly, these repurposed drugs exerted their antitumor effects without directly inhibiting NDRG1 protein expression, potentially avoiding adverse effects associated with suppressing the tumor-suppressive variant of NDRG1. Instead, their mechanism of action involved the blockade of AKT, as evidenced by reduced expression of its phosphorylated (Ser347) form in immunoblot analyses. Given that chemoresistance is one of the main obstacles that TNBC tumors develop, we also assessed our repurposed drugs in a docetaxel-resistant cell line that we had previously established. Efavirenz and ouabain exhibited more sensitivity compared to their parental cell line. Conversely, vinburnine was able to re-sensitize TNBC cells when combined with docetaxel. To enhance the translational potential of our findings, we attempted to assay our repurposed drugs in TNBC patient-derived organoids (PDOs). We could not successfully establish long-term PDOs cultures, probably due to the limited amount of biopsy tissue. To overcome this limitation, we established three TNBC patient-derived xenograft (PDX) models, which were subsequently digested to produce PDXderived organoids (PDxOs). One model (UGR01) successfully grew in vitro, demonstrating the absence of the murine population and recapitulating histopathological features of the TNBC patient origin. In this model, our three repurposed drugs effectively reduced cell viability, both as monotherapies and in combination with docetaxel. Immunofluorescence staining corroborated the downregulation of phosphorylated AKT in treated PDxOs and the reduction of cell proliferation using Ki67 marker. In conclusion, this project develops a comprehensive study that starts from unraveling the intrinsic aggressiveness of NDRG1 in TNBC to the validation of repurposed drugs in a patient-derived model. We present the rational choice of repurposing method to avoid malignant direct inhibition of NDRG1. Furthermore, we assess the effects on cell viability, apoptosis, CSC properties, migration, and EMT in adherent TNBC cell lines and the mechanism of action. To conclude, we validate our results in a PDxOs model that resembles the patient’s characteristics. These findings support the importance and value of drug repurposing to enhance a new era of drug development against cancer.

El cáncer de mama triple negativo (TNBC, por sus siglas en inglés) es el tipo más agresivo de cáncer de mama, presentando altas tasas de recaída, metástasis y mortalidad. A pesar de los recientes avances terapéuticos para el TNBC metastásico, persiste una necesidad crítica de nuevos biomarcadores y terapias dirigidas para mejorar los resultados clínicos de los pacientes. NDRG1 (del inglés, N-Myc downstream regulated gene 1) exhibe una actividad pleiotrópica en varios tipos de cáncer, incluyendo el TNBC. Sin embargo, su mecanismo de acción intrínseco sigue sin comprenderse completamente. Basándonos en nuestra investigación previa, que demostró una expresión elevada de NDRG1 tras la estimulación agresiva con TGF-β, planteamos la hipótesis de que esta vía podría mediar el papel tumorigénico de NDRG1 en el TNBC. Inicialmente, observamos que los niveles elevados de expresión génica de NDRG1 se correlacionaban con una peor supervivencia en pacientes con TNBC mediante análisis de dos bases de datos públicas: Kaplan-Meier plotter y GOBO. Corroboramos estos hallazgos mediante la evaluación inmunohistoquímica de la expresión proteica de NDRG1 en una cohorte de 83 pacientes con TNBC. En consecuencia, concluimos que una alta expresión de NDRG1 era indicativa de un mal pronóstico en comparación con una expresión más baja. Posteriormente, investigamos la modulación de la actividad de TGF-β y NDRG1. Elucidamos que la actividad de NDRG1 depende de la estimulación por TGF-β y del origen de las células tumorales. En células derivadas de efusión pleural (MDA-MB-231, MDA-MB-436), la inhibición de NDRG1 tras la estimulación con TGF-β redujo la migración, la invasión y la expresión de Vimentina, mientras que estos efectos no se observaron en líneas celulares derivadas de tumores primarios (SUM159, BT549). También examinamos procesos oncogénicos clave, incluyendo el mantenimiento de poblaciones de células madre cancerosas (CSC, por sus siglas en inglés) mediante citometría de flujo. Notablemente, las células de tumores primarios requirieron una estimulación prolongada con TGF-β para potenciar la agresividad mediada por NDRG1. Esto sugiere que, después de la metástasis, una breve exposición a TGF-β es suficiente para inducir un comportamiento agresivo. NDRG1 reguló el mantenimiento de CSCs ALDH1+ en las cuatro líneas celulares, mientras que las CSCs CD44+/CD24low/– y la “side population” se mantuvieron solo en células derivadas de tumores primarios. Considerando estos hallazgos y el potencial papel supresor tumoral de NDRG1 en algunos pacientes con TNBC, buscamos un enfoque alternativo a la inhibición directa de NDRG1. Para identificar fármacos que imiten la firma transcriptómica antitumoral resultante de la inhibición de NDRG1 inducida por TGF-β, realizamos un estudio de Connectivity Map. El reposicionamiento de fármacos ha surgido como un enfoque prometedor y eficiente para investigar nuevas terapias, evitando el largo y costoso proceso que implican los fármacos de novo. Como habíamos observado que la inhibición de NDRG1 tras la estimulación con TGF-β producía una firma antitumoral, seleccionamos tres candidatos que podrían producir una expresión génica semejante, la cual se estudió mediante la técnica de secuenciación de ARN. Nuestro enfoque basado en firmas condujo a la selección de efavirenz, ouabaína y vinburnina como nuestros fármacos candidatos reposicionados. Para validar su eficacia, realizamos diferentes evaluaciones. Estos compuestos redujeron significativamente la proliferación de células tumorales, las poblaciones de CSC, la capacidad de autorrenovación, las propiedades clonogénicas y las capacidades migratorias en líneas celulares de TNBC adherentes. Además, dada la ausencia de estudios con combinaciones de fármacos reposicionados en la investigación del cáncer, también analizamos los efectos de las combinaciones por pares de nuestros candidatos. Notablemente, la combinación de efavirenz + ouabaína (EO) demostró una eficacia superior en la reducción de las propiedades fenotípicas de las CSC. Además, estudiamos sus efectos en los marcadores de transición epitelio-mesénquima (EMT, por sus siglas en inglés) mediante immunoblot y observamos que reducían las expresiones proteicas de Snail y Slug. Es importante destacar que estos fármacos reposicionados ejercieron sus efectos antitumorales sin inhibir directamente la expresión proteica de NDRG1, evitando potencialmente los efectos adversos asociados con la supresión de la variante supresora de tumores de NDRG1. En su lugar, su mecanismo de acción implicó el bloqueo de AKT, como se evidenció por la reducción de la expresión de su forma fosforilada (Ser347) mediante immunoblot. Dado que la quimiorresistencia es uno de los principales obstáculos que desarrollan los tumores TNBC, también evaluamos nuestros fármacos reposicionados en una línea celular resistente a docetaxel que habíamos establecido previamente. Efavirenz y ouabaína exhibieron mayor sensibilidad en comparación con su línea celular parental. Por el contrario, la vinburnina fue capaz de resensibilizar las células TNBC cuando se combinó con docetaxel. Para mejorar el potencial traslacional de nuestros hallazgos, intentamos estudiar nuestros fármacos reposicionados en organoides derivados de pacientes (PDOs) con TNBC. No pudimos establecer con éxito cultivos de PDOs a largo plazo, probablemente debido a la cantidad limitada de tejido de biopsia. Para superar esta limitación, establecimos tres modelos de xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) con TNBC, que posteriormente se digirieron para producir organoides derivados de PDX (PDxOs). Un modelo (UGR01) creció con éxito in vitro, presentando ausencia de población murina y recapitulando las características histopatológicas del origen del paciente con TNBC. En este modelo, nuestros tres fármacos reposicionados redujeron eficazmente la viabilidad celular, tanto como monoterapias como en combinación con docetaxel. La tinción por inmunofluorescencia corroboró la disminución de la expresión de la forma fosforilada de AKT en los PDxOs tratados y la reducción de la proliferación celular utilizando el marcador Ki67. En conclusión, este proyecto desarrolla un estudio integral que parte de desentrañar la agresividad intrínseca de NDRG1 en TNBC hasta la validación de fármacos reposicionados en un modelo derivado de pacientes. Presentamos la elección racional del método de reposicionamiento para evitar la inhibición directa de NDRG1. Además, evaluamos los efectos sobre la viabilidad celular, apoptosis, propiedades de las CSC, migración y EMT en líneas celulares de TNBC adherentes y el mecanismo de acción. Para concluir, validamos los resultados en un modelo de PDxOs que mantiene las características del paciente. Estos hallazgos respaldan la importancia y el valor del reposicionamiento de fármacos para potenciar una nueva era de desarrollo de fármacos contra el cáncer.