El papel de los microARNs en el diagnóstico y pronóstico del cáncer de mama

Abstract

Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer worldwide in women and the second most common overall, also being the leading cause of cancer mortality in women. In recent years, significant advances have been made in the diagnosis and treatment of this disease, with two key points for effective breast cancer management: 1) earlystage diagnosis and 2) providing timely treatment following diagnosis. Five-year survival rates are 99% when the cancer is localized and 86% when breast cancer is loco-regional. However, five-year survival falls to 31% when the patient presents with distal metastasis to other organs. Among breast cancer screening and diagnostic techniques, mammography is currently the gold standard. However, when an abnormality is detected, a breast biopsy is still necessary to confirm the diagnosis, an invasive procedure that is not recommended for all cancer patients. Similarly, invasive is the early detection of lymph node metastasis (LNM) through sentinel lymph node biopsy. This technique is also limited to patients undergoing initial surgery or neo-adjuvant chemotherapy. These limitations have highlighted the need for new diagnostic and prognostic markers in breast cancer. In this context, microRNAs present themselves as important gene regulators in breast cancer, whose expression variation reflects tumor activity. This doctoral thesis proposes microRNAs as potential markers, evaluating their role at two different stages of the disease: 1) in early-stage breast cancer and 2) in breast cancer with lymph node metastasis. This research was approached from two angles: first, a bioinformatic approach, which included an exhaustive review of all existing literature on the role of microRNAs in LNM, to then confront this data in a meta-analysis and offer a resulting biomarker from the combination of all studies analyzed. Second, a sequencing of microRNAs encapsulated in extracellular vesicles, thanks to their protection against RNAases and pathological status information, was conducted from two cohorts of breast cancer patients, one in early stages and the other with metastasis to distal organs, as well as a cohort of healthy donors, to analyze expression changes between cancer and noncancer states, and in disease progression. The results obtained in the meta-analysis showed a total of two microRNAs differentially expressed between patients with localized early-stage breast cancer and patients with breast cancer with LNM: miR-34a and miR-155. miR-34a, which was down-regulated compared to localized cancer, is a tumor suppressor in the p53 network, while miR- 155, overexpressed compared to localized stages, is an oncogene widely proven to promote breast cancer. This analysis provides a potential diagnostic signature of lymph node metastasis in breast cancer, pending future experimental validation. On the other hand, the sequencing of microRNAs transported in extracellular vesicles yielded a total of three microRNAs that met the criteria for significant differential expression between groups: miR- 320b, miR-423-5p, and miR-141-3p. Bioinformatic analysis showed that these microRNAs were involved in other hormone-related cancers, such as prostate and endometrial cancer. It was also found that silencing the target genes of these microRNAs affected key breast pathways, such as proteoglycan production, progesterone-mediated oocyte maturation, and ovarian steroidogenesis. Similarly, validation of these microRNAs in an independent cohort from the first one, comprising early-stage and metastatic breast cancer patients, as well as healthy donors, showed a variation in differential expression between groups for miR-423-5p. In a second marker validation between healthy women and women with early-stage breast cancer, this microRNA showed large expression differences, with high levels also correlated with the presence of breast cancer. The location of miR-423-5p in extracellular vesicles was also studied, as well as its presence or absence in EpCAM+ vesicles, hypothesized to be tumor-derived. In cancer patients, miR-423 was found both inside and outside the overall EVs, while in healthy women it was found mainly inside the EVs. After pulling down EVs employing anti-EpCAM immune-magnetic precipitation, this miRNA was also observed in association with EpCAM+ vesicles. Overall, these results suggest that EVs associated miR-423-5p could be a good candidate for the identification of breast cancer patients from healthy women. Additionally, its increased in extracellular vesicles make it a potential clinical tool for evaluating disease progression, as its study is minimally invasive and can be repeated over time. However, further studies in large cohorts are needed to confirm its clinical utility and additional studies in patients with different stages of breast cancer and breast symptoms and pathologies.

El cáncer de mama es el tipo de cáncer más diagnosticado a nivel mundial en mujeres y el segundo en general, siendo además la primera causa por mortalidad de cáncer en mujeres. En los últimos años se han realizado grandes avances en el diagnóstico y tratamiento de esta enfermedad, con dos puntos clave para el manejo del cáncer de mama efectivo: 1. El diagnóstico en estadios tempranos y 2. proporcionar un tratamiento oportuno tras el diagnóstico. Los datos de supervivencia a los 5 años cuando el cáncer es localizado son del 99% y del 86% cuando el cáncer de mama es loco-regional. Sin embargo, la supervivencia a los 5 años cae hasta el 31% cuando la paciente presenta metástasis distal a otros órganos. Entre las técnicas de screening y diagnóstico del cáncer de mama, la mamografía es actualmente el gold standard. Sin embargo, cuando una anomalía es detectada, sigue siendo necesario realizar una biopsia de la mama para certificar el diagnóstico, un procedimiento invasivo y no recomendado para todas las pacientes con cáncer. Igualmente invasiva es la detección temprana de metástasis en nódulos linfáticos (MNL), mediante biopsia del ganglio linfático centinela. Esta técnica está además limitada a pacientes sometidas a una cirugía inicial o con quimioterapia neoadyuvante. Estos inconvenientes han puesto de manifiesto la necesidad de encontrar nuevos marcadores tanto diagnósticos como pronósticos en el cáncer de mama. En este sentido, los microARNs se presentan como importantes reguladores génicos en el cáncer de mama, cuya variación en la expresión actúa como reflejo de la actividad tumoral. Esta tesis doctoral propone los microARNs como potenciales marcadores, evaluándose su papel en dos puntos distintos de la enfermedad: 1. en el cáncer de mama en estadios tempranos y 2. En el cáncer de mama con metástasis en los nódulos linfáticos. Para ello, esta investigación se abordó desde dos aproximaciones: Una primera aproximación bioinformática, en la que se ejecutó una revisión exhaustiva de toda la literatura existente sobre el papel que juegan los microARNs en la MNL para, posteriormente, confrontar esos datos en un metaánalisis y ofrecer un biomarcador resultante de la conjunción de todos los estudios analizados. En segundo lugar, se realizó una secuenciación de los microARNs encapsulados en vesículas extracelulares, gracias a la protección que proporcionan frente a la degradación por ARNasas y su información sobre el estado patológico del organismo, de dos cohortes de pacientes con cáncer de mama, una en estadios tempranos y otra con metástasis en órganos distales, así como una cohorte de donantes sanas, con el fin de analizar los cambios de expresión entre cáncer-no cáncer, y en la progresión de la enfermedad. Los resultados obtenidos en el metaanálisis mostraron un total de dos microARNs diferencialmente expresados entre pacientes con cáncer de mama temprano localizado y pacientes con cáncer de mama con MNL: miR-34a y miR-155. MiR-34a, que resultó regulado a la baja en comparación con el cáncer localizado, es un supresor tumoral perteneciente a la red de p53 mientras que miR-155, sobre-expresado en comparación con estadios localizados, es un oncogén cuya relación con el cáncer de mama como promotor de la enfermedad está ampliamente demostrada. Este análisis ofrece una potencial firma diagnóstica de la metástasis en nódulos linfáticos en cáncer de mama, pendiente de futuras validaciones experimentales. Por otro lado, la secuenciación de los microARNs transportados en vesículas extracelulares resultó en un total de tres microARNs que cumplieron los criterios de expresión diferencial significativa entre grupos: miR-320b, miR-423-5p y miR-141-3p. Mediante análisis bioinformáticos, se vio que estos microARNs estaban involucrados en otros cánceres de tipo hormonal, como el cáncer de próstata y el cáncer de endometrio. También se comprobó que el silenciamiento de los genes dianas de estos microARNs afectaba en la mama a rutas importantes como la producción de proteoglicanos, la maduración de los oocitos mediante la progesterona, o la esteroidogenesis ovárica. Así mismo, la validación de estos microARNs en una cohorte independiente a la primera de pacientes con cáncer de mama temprano y metastásico, así como donadoras sanas, mostró una variación de la expresión diferencial entre grupos del miR-423-5p. En una segunda validación entre mujeres sanas y mujeres con cáncer de mama temprano, este microARN presentó grandes diferencias de expresión, estando además correlacionado sus niveles altos con la presencia de cáncer de mama. También se estudió la localización de miR-423-5p en las vesículas extracelulares en general, así como su presencia o ausencia en vesículas EpCAM+, hipotetizadas como tumorales. Así, se vio que, en pacientes con cáncer, miR-423 estaba tanto dentro como fuera de la vesícula en general, probablemente resultado de los procesos de vertido y de inflamación durante el cáncer, mientras que en mujeres sanas se encontró principalmente en el interior de la vesícula. Igualmente, este miRNA estuvo presente en vesículas EpCAM+. En conjunto, estos resultados sugieren que miR-423-5p podría ser un buen candidato para diferenciar pacientes con cáncer de mama de mujeres sanas. Además, su incremento de expresión y su presencia tanto en vesículas extracelulares como circulante, lo hacen una potencial herramienta clínica para evaluar la evolución de la enfermedad, siendo su estudio poco invasivo y repetible a lo largo del tiempo. Sin embargo, más estudios son necesarios para avalar su utilidad clínica, sobre todo en pacientes con cáncer de mama metastásico.